脊椎動物的血-脊髓屏障（blood-spinal cordbarrier,BSCB） 是血腦屏障（blood-brain barrier,BBB）的延伸，是中樞神經系統特有的屏障結構。BSCB 由脊髓微血管內皮細胞 （spinal cord mi-crovascular endothelial cell,SCMEC） 間的緊密連接及星形膠質細胞周足構成，可有效地阻止血液中的大分子進入脊髓實質，為中樞神經系統提供穩定的微環境[1].現有研究表明，多種脊髓病變與BSCB 屏障功能異常有關，如創傷性脊髓損傷[2, 3]、放射性損傷[4]、肌萎縮性脊髓側索硬化癥[5, 6]、感染[7]等。內皮細胞間的連接蛋白及細胞骨架是構成內皮細胞屏障的主要分子基礎，其表達量、分布及相互作用的改變是導致內皮細胞通透性增高的直接原因[8].
血管生成素（angiopoietin,Ang1）是一種有效的血管生成因子，參與血管生成的各個階段，許多其他血管生成因子可通過 Ang1 誘導新血管的生成。在血腦屏障，Ang1 作用于 Tie-2 酪氨酸激酶受體，參與維持屏障完整性及血管穩定[9, 10];近期有研究報道，Ang1 可通過上調緊密連接蛋白 ZO-2（zonula occludens-2）穩定腦微血管內皮細胞[11].在非中樞神經系統微血管內皮細胞，Ang1 可通過PI3K/Akt 途徑發揮抗凋亡[12]及維持血管穩定性的作用[13].本研究以分離培養的大鼠 SCMEC 為研究對象，在體外建立 BSCB 模型，探討 Ang1-Akt 途徑對血脊髓屏障的通透性影響并初步分析其作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與試劑
成熟 Sprague-Dawley 大鼠（275~300 g）由中國醫科大學實驗動物部提供。DMEM/F12 培養基為 Sigma 公司（美國）產品；堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、血管內皮生長因子（VEGF）、血管生成素 1（Ang1）購自 Peprotech 公司（美國）；Wort-mannin 購自 Gene Operation（中國）；蛋白 G 瓊脂糖購自 Pierce 公司 （美國）；PKA 抑制肽購自Merck Millipore 公司（德國）；組蛋白 H2B 為 EnzoLife Sciences 公司（瑞士）產品；[γ-32P]ATP 購自北京福瑞生物科技有限公司（中國）；兔 IgG、兔抗大鼠 occludin、ZO-1、β-catenin 抗體、驢抗兔 IgG（FITC）、Prolong Gold Antifade 封片劑購自 Invit-rogen 公司（美國）；山羊抗大鼠 Akt1、β-actin、兔抗大鼠 pAkt 抗體、?？股窖?IgG（HRP）、?？雇?IgG（HRP） 購自 Santa Cruz 公司（美國）；兔抗大鼠VE-cadherin 購自 Abcam 公司（美國）；DC 蛋白定量試劑盒購自 Bio-Rad 公司（美國）；增強型化學發光試劑盒購自 Pierce 公司（美國）；其他常規試劑為 Sigma 公司（美國）產品。
1.2 主要儀器設備
Millicell誖ERS-2 細胞電阻儀；Millipore Milli-cell 插入式細胞培養皿；Beckman 液閃計數儀；Bio-Rad 電泳儀及電泳槽；Eppendorf 臺式低溫離心機；蘇凈 VS-1300U 超凈臺；Thermo ScientificSeries8000 CO2細胞培養箱；Olympus BX51 熒光顯微鏡。
1.3 實驗方法
1.3.1 大鼠脊髓微血管內皮細胞 （SCMEC）的分離培養。按本實驗室常規方法分離培養大鼠 SCMEC.
成熟 SD 大鼠 CO2窒息處死，手術分離椎管后注射冷 D-Hanks 液以分離脊髓組織，去除腦脊膜及大血管。冷 DMEM/F12 培養液中剪碎組織至1 mm3大小，冰上勻漿后于 37 ℃水浴膠原酶Ⅱ消化 30 min.消化產物 200 g 離心 5 min,22% BSA重懸組織沉淀，2 000 g 離心 10 min,棄上層髓磷脂成分，DMEM/F12 清洗下層血管組織。無菌濾器（BD Falcon,295 μm 及 40 μm） 依次過濾以進一步去除大血管及血細胞，收集微血管組分。0.1%膠原酶及脂肪酶于 37 ℃消化脊髓微血管 30 min,間歇攪拌并鏡下觀察，待內皮細胞出芽呈串珠樣時 1 000×g 離心 5 min 終止消化。SCMEC 培養液（DMEM/F12、10%胎牛血清、10%馬血清、2 mmol/L谷氨酸鈉、1 g/L 肝素、1 μg/L bFGF、10 μg/L VEGF、50 mg/L 慶大霉素、3 μmol/L 嘌呤霉素）重懸消化后的微血管組分，接種于預鋪 IV 型膠原及纖連蛋白（均為 5 μg/cm2）的培養平板，接種密度為 1×104/cm2.培養 6 d 待細胞融合成單層后常規免疫熒光觀察因子Ⅷ表達情況，確定 SCMEC 分離培養純度﹥95%.0.125%胰酶（含 0.02% EDTA）消化 SCMEC,按不同密度進行傳代：1） 1∶1 接種于 6 孔培養板，用于蛋白樣品制備；2） 1:5 接種于 6 孔培養板（內預置蓋玻片），用于細胞免疫熒光；3） 1∶1 接種于Millicell 插入小室，置于 24 孔板（預鋪膠質細胞）中，用于跨內皮電阻（TEER）測定。所有培養細胞于 37 ℃ 5% CO2培養箱中培養 7 d,每 2~3 d 更換培養液。
1.3.2 血管生成素 1 （Ang1）處理培養細胞為檢測 Ang1 對體外 SCMEC 屏障功能的影響，于培養第 7 d 用 Ang1 （0.1 mg/L） 或 Ang1（100 mg/L）+Wortmannin（0.1 μmol/L）處理細胞12 h,于不同時間點（0、4、8、12 h）測量 Ang1 處理后跨內皮電阻變化，并收集 SCMEC 進行激酶活性測定及免疫印跡等檢測。
1.3.3 Akt 激酶活性測定
通過測定 Akt 底物蛋白 H2B 的磷酸化狀態反映 Akt 激酶活性，具體如下：收集 SCMEC 制備蛋白裂解液，蛋白 G 瓊脂糖 4 ℃預孵育 30 min 后加入抗 Akt 抗體免疫沉淀 2 h,離心后依次用裂解液、純水及激酶反應液（50 mmol/L HEPES、10 mmol/LMnCl2、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L 二硫蘇糖醇、1μmol/L PKA 抑制劑，pH 7.2）清洗沉淀。在反應液中加入 20 μCi/mL[γ-32P]ATP 及 0.2 g/L 組蛋白 H2B,30 ℃孵育 10 min.取 25 μL 反應液滴于 Whatmanp81 陽離子交換濾紙，5%磷酸溶液終止反應，充分清洗后放入含 10 mL 蒸餾水的液閃瓶內，Beckman液閃計數儀測定 cpm 值。
此外，本研究亦采用放射自顯影檢測 Akt 激酶活性，即在上述激酶反應液中加入 50 μCi/mL[γ-32P]ATP 及組蛋白底物，30 ℃孵育 30 min 后用SDS 樣品緩沖液終止反應，SDS-PAGE 分離蛋白成分后放射自顯影觀察 H2B 的磷酸化狀態。
1.3.4 跨內皮電阻（TEER）測定
使用 Millicell誖ERS-2 細胞電阻儀測量雙室培養系統中 SCMEC 跨內皮電阻值，以反映其內皮屏障功能及通透性。在 Ang1 處理后不同時間點（每個時間點設置 3 個平行孔），將正負電極分別置于培養內室及外室，記錄待測孔電阻值（Ru），按公式 TEER=（Ru-Rc）×S 計算各組 TEER值（Ω·cm2），其中 Rc 為未接種細胞空白孔電阻值，S 為培養面積。
1.3.5 免疫印跡及免疫共沉淀
收 集 各 組 SCMEC,Nonidet P -40 裂 解 液（50 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,2 mmol/L EG-TA,10% glycerol,1% Nonidet P -40,2 mmol/LPMSF,1 mmol/L Na3VO4,1 μg/mL 亮肽素，1 mg/L抑肽酶，pH 7.4） 處理后提取總蛋白，BCA 定量法測定蛋白濃度后制備蛋白樣品。每組按 30 μg 上樣量進行 SDS-PAGE 電泳分離蛋白成分，轉印至PVDF 膜，50 g/L 脫脂奶粉封閉，依次經一抗、二抗孵育后進行 ECL 顯色（β-actin 做為內參照）。
免疫共沉淀實驗中每組取 400 μg 蛋白裂解液，用 2 μg 兔 IgG 進行預處理，加入蛋白 A 瓊脂糖珠離心后，取上清加入 2 μg IP 抗體（ZO-1 或VE-cadherin,另設無 IP 抗體 IgG 對照），室溫于旋轉混勻過夜，加入蛋白 A 瓊脂糖珠沉淀抗原抗體復合物，離心后用上樣緩沖液處理瓊脂糖珠，煮沸變性，SDS-PAGE 分離蛋白后按上述方法進行免疫印跡分析（抗 occludin 或抗 β-catenin 抗體）。
1.3.6 細胞免疫熒光
4% 多聚甲醛固定經 Ang1 處理 12 h 后的SCMEC,0.1% Triton-100 通透，5%牛血清白蛋白封閉，依次經抗 ZO-1 或 VE-cadherin 抗體及FITC 標記 IgG 孵育后，Prolong Gold Antifade 封片劑（含 DAPI）封片，于 Olympus BX51 熒光顯微鏡下觀察結果。
1.3.7 統計學分析
本研究中 TEER、免疫印跡、放射自顯影等實驗結果均采用 GB-STAT 軟件 （Dynamic Microsys-tems） 進行雙因素方差分析及 Dunnett's 檢驗，P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異非常顯著，有統計學意義。
2 結果
2.1 Ang1 處理增強體外培養 SCMEC 中 Akt 激酶活性。
體 外 分 離 大 鼠 脊 髓 微 血 管 內 皮 細 胞（SCMEC），建立體外血-脊髓屏障。由于在培養的內皮細胞系中 Ang1 可通過 Akt-PI3K 途徑影響內皮細胞活力及血管生成過程[1],在本研究中我們首先檢測了 Ang1 對 SCMEC 中 Akt 活性的影響。分別用 Ang1、Ang1+Wortmannin（WM,PI3K/Akt 途徑抑制劑） 處理傳代培養第 7 d 的 SCMEC單層，預處理后 0 h、4 h、8 h、12 h 收集各組細胞。免疫印跡結果顯示，Ang1 處理 4 h 后，Akt1 磷酸化水平與對照組相比有明顯升高，Wortmannin 則可抑制Ang1 引起的 Akt1 磷酸化（圖 1A、C）；以組蛋白 H2B為底物，放射自顯影（圖1B）及液閃計數（圖 1D）均顯示Ang1處理后，Akt活性有顯著增高。該結果說明，Ang1 在本研究分離培養的 SCMEC 中可以活化Akt,且該作用可被 Wortmannin 所抑制。
2.2 Ang1 通 過 影 響 Akt 活 性 增 強 體 外 培 養SCMEC 屏障功能。
為確定 Ang1-Akt 通路對 BSCB 屏障功能的影響，在 Ang1 處理雙室培養的 SCMEC 后不同時間點測定跨內皮電阻（TEER）。結果顯示，Ang1 處理后 4 h,SCMEC 單層上皮 TEER 值與對照組相比明顯升高，即 Ang1 可增強體外培養 SCMEC 屏障功能；此外，該效應可被 Wortmannin 所拮抗，即與 Ang1 處理組相比，Ang1+WM 組 TEER 值有所下降（圖 2）。該結果表明，Ang1 可能通過影響 Akt活性增強體外培養 SCMEC 屏障功能。
2.3 Ang1-Akt 通路影響連接蛋白在 SCMEC 細胞連接處的分布
為進一步明確 Ang1-Akt 途徑影響 SCMEC屏障功能的機制，我們檢測了幾種細胞連接蛋白（occludin、ZO-1、VE-cadherin、β-catenin 等）經Ang1 處理后在細胞連接處的分布變化。為更清晰地觀察細胞接觸面，我們在細胞免疫熒光試驗中采用 1∶5 比例進行傳代培養，在該培養條件下，SCMEC 大多（>60%）呈現多角形。結果表明，緊密連接蛋白 ZO-1 及粘著連接蛋白 VE-cadherin 在Ang1 處理后在細胞連接處的分布顯著增強，而Ang1+WM 組則無此改變（圖 3），提示 Ang1 可通過 Akt 活性影響連接蛋白在細胞表面的分布，從而增強 SCMEC 的屏障功能。
2.4 Ang1-Akt 通路影響 SCMEC 連接蛋白間的相互作用。
在觀察到 Ang1 對 ZO-1 及 VE-cadherin 在細胞連接處的分布影響后，我們進一步通過免疫共沉淀檢測了細胞連接蛋白間的相互作用改變。在 Ang1 處理 12 h 后，收集 SCMEC 裂解液，統計分析 Co-IP 結果顯示，Ang1 可以增強 occludin/ZO-1 及 VE-cadherin/β-catenin 之間的相互作用分別達 200%及 150%以上，而 Ang1+WM 組與Ang1 處理組相比則抑制了連接蛋白間的相互作用，表明 Ang1-Akt 途徑可通過促進細胞連接復合體的形成提高 SCMEC 的內皮屏障功能（圖 4）。
3 討論
脊髓微血管內皮細胞（SCMEC）在構成血脊髓屏障（BSCB） 中的功能與腦微血管內皮細胞（BMEC）構成血腦屏障（BBB）中的作用類似，近年來在血中樞神經系統屏障的研究中建立了許多成功模擬 BBB 或 BSCB 的體外模型[14~16].本研究通過分離培養成熟 SD 大鼠脊髓微血管，在適當條件下消化培養 SCMEC,經因子Ⅷ特異性抗體檢測，SCMEC 純度可達 95%[14, 15];在此基礎上，于雙室培養系統中共培養 SCMEC 和膠質細胞（已知后者可誘導中樞神經系統血腦屏障的形成[17]），通過每日測定 TEER 反映內皮屏障功能，發現在該培養條件下經 6~7 d 的培養，TEER 值可達 45~60Ω·cm2,表明成功建立體外 BSCB 模型。
Ang1 基因位于染色體 8q22,由 498 個氨基酸組成，主要由周細胞及血管平滑肌細胞表達，作用于內皮特異性酪氨酸激酶受體 Tie-2,其同源蛋白 Ang2 為其天然的競爭性拮抗劑。轉基因研究證實，Ang1 基因缺失或 Tie-2 基因敲除的小鼠胚胎血管形成障礙、通透性增高且缺乏連續性從而不能形成血管網；而 Ang1 過表達的轉基因動物則表現為血管增生變粗且內皮細胞與周細胞的連接完整[18].Ang1 在維持血管穩定性方面發揮重要作用，有報道稱其中涉及 Akt 介導的抗凋亡效應[9, 12];此外，Ang1 可通過激活磷脂酰肌醇激酶（PI3K）引起柱蛋白（paxillin）磷酸化，加強內皮-基質間的相互作用，增加內皮管狀結構的完整性。
在本研究中，我們首先檢測了 Ang1 對體外培養的脊髓微血管內皮細胞 Akt 激酶活性的影響，即用 Ang1 處理培養 SCMEC 后收集細胞裂解液，采用[32P]-摻入試驗測定激酶活性，放射自顯影及液閃計數結果均顯示 Ang1 處理后可引起 SCMEC中的 Akt 活性增高。結合以往報道，該結果提示Ang1 對 PI3K/Akt 途徑的調節作用在內皮細胞中是普遍存在的。在此基礎上，我們又進一步檢測了Ang1 對體外 BSCB 屏障功能的影響，TEER 測定結果表明 Ang1 處理 4 h 后，SCMEC 屏障功能顯著增強，同時發現該作用可被 PI3K/Akt 途徑特異性抑制劑 Wortmannin 所拮抗，說明 Ang1 可通過影響 Akt 活性調節 BSCB 功能，降低其通透性，維持 BSCB 的穩定。
在內皮屏障結構中，相鄰內皮細胞間的細胞連接的形成及完整性對內皮通透性的維持至關重要。因此，我們檢測了 Ang1 處理后幾種連接蛋白（occludin、ZO -1、ZO -2、VE -cadherin、β -catenin）的表達情況，免疫印跡結果顯示無明顯改變，說明Ang1 不是通過影響連接蛋白的表達量調節 BSCB的通透性。進一步通過免疫熒光技術發現，Ang1處理后支架蛋白 ZO-1 與鈣黏蛋白 VE-cadherin在細胞接觸面的分布明顯增加；此外，緊密連接蛋白 occludin 與 ZO-1,以及 VE-cadherin 與連環蛋白 β-catenin 之間的相互作用也在 Ang1 處理后增強，且 Ang1 所引起的效應均可被 PI3K-Akt 途徑抑制劑 Wortmannin 所抑制。
綜上結果表明，Ang1 可通過 Akt 改變連接蛋白在 SCMEC 細胞連接處的分布狀態，并影響連接蛋白之間的直接作用，從而改變 BSCB 的通透性及屏障功能，該結論仍需進一步在體內研究中進行驗證。此外，Ang1 還可通過其他途徑參與維持血管穩定性及誘導新血管生成，如有研究表明Ang1 可促進胞漿素和金屬基質蛋白酶-2（MMP-2）的分泌和基底膜的降解，從而促進內皮遷移和管狀結構生成，還可通過降低血小板內皮細胞粘附分子（PECAM）的磷酸化加強內皮間的連接，維持微血管壁的完整性[19]等等，這些信號轉導分子在 Ang1 調節 BSCB 屏障功能的過程中是否發揮作用仍需進一步的研究闡明。
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