釉成熟蛋白（amelotin）是一種在人的成釉細胞特異性表達的蛋白，在小鼠、豬、大鼠等物種中高度保守，相對分子質量（Mr）21 000 ~ 38 000[1 -3].小鼠amelotin 全長 cDNA 序列為 1022 bp,編碼 213 個氨基酸，富含亮氨酸、脯氨酸、蘇氨酸殘基，與人的amelotin 高度同源[4 - 6].Amelotin 家族成員在 5'端均具有 16 個氨基酸的信號肽序列[7],因而它們可能是一種分泌性的蛋白。研究發現，amelotin 參與釉質的發育、成熟過程，其結構和功能的改變與釉質發育相關疾病有密切關系[8 -10].國外公司有商品化的抗體出售，價格昂貴，并且特異性不強，靈敏度不高，無法滿足目前的實驗要求。本課題組曾根據 amelotin的全長氨基酸序列，應用構建重組融合蛋白的方法制備了 amelotin 多克隆抗體[11],但是該方法制備的抗體的特異性及效價已經不足以滿足我們的后續實驗需要； 并且該方法制備抗體的過程程序繁瑣，耗時較長，影響實驗進程。為進一步探討 amelotin 在釉質的發育、成熟過程中的功能，我們應用設計合成多肽的方法制備了效價高、特異性好的 amelotin 多肽多克隆抗體，其識別抗原表位的能力更強。
1 材料和方法
1. 1 材料
完全 Freund 佐劑（complete Freund's adjuvant,CFA）、不完全 Freund 佐劑（incomplete Freund's adjuvant,IFA）、丙烯酰胺購自 Sigma 公司； 牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA） 、多聚賴氨酸、辣根過氧化物酶（ horseradish peroxidase,HRP）標記的山羊抗兔 IgG、ABC 免疫組織化學檢測試劑盒、DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司； 放射免疫沉淀技術（radioimmunoprecipitation assay,RIPA）裂解液、二辛可寧酸（bicinchonininc acid,BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天公司； 聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF） 膜購自 Roche 公司； ECL Plus 化學發光試劑盒購自Santa Cruz 公司。出生后 3、7 d 昆明小鼠各 2 只，新西蘭大白兔 2 只（3 kg/只）由濰坊醫學院實驗動物中心提供。
1. 2 方法
1. 2. 1 Amelotin 抗原表位的分析 由 GenBank 蛋白質數據庫中獲取 amelotin 蛋白氨基酸序列，利用在線蛋白分析工具ANTHEPROT 5. 0、DNA Star 等進行親水性 （ hydrophilicity） 、表面可及性（surface accessibility）、柔韌性（flexicity）、抗原性和二級結構等參數的綜合預測，并應用 Blast 程序進行同源性和保守性分析，最終確定需要合成的多肽序列。
1. 2. 2 兔抗 amelotin 多肽抗體的制備 Amelotin 多肽由武漢三鷹生物有限公司合成，將合成的 amelotin 多肽肽鏈與鑰孔戚血藍素（keyhole limpet hemacyanin,KLH）采用戊二醛連接法進行交聯[3],形成 amelotin-KLH 偶聯物，此大分子物質即為我們之后免疫動物所用的半抗原。取 2 mg（1000 μL）的多肽 KLH 偶聯物與等體積的 CFA 混合，充分乳化。在新西蘭大白兔背部選取 4 個注射點進行注射，每點約 250 μL.4 周后加強免疫 1 次，用 IFA 將劑量減半的多肽偶聯抗原充分乳化后進行背部注射。之后 2 周加強免疫 1 次。兔耳緣靜脈采血進行抗血清效價測定，達理想效價后，再次注射無佐劑的amelotin-KLH 抗原 250 μL / 點，加強免疫 1 次，3 d 后頸動脈放血，收集并分離血清，無菌分裝，-80℃保存備用。
1. 2. 3 Amelotin 多肽抗體的純化 采用親和層析法進行多肽抗體純化。首先將 1 mg amelotin 多肽與溴化氰（cyanogenbromide,CNBr）活化后的 Sepharose 4B 偶聯，制備多肽親和層析凝膠。取 20 mL 兔抗 amelotin 血清與 1. 6 mL 多肽偶聯凝膠，4℃旋轉混合 6 h,加入層析柱； PBS 沖洗平衡凝膠，之后加入 1 mL 0. 1 mol/L pH2. 9 甘氨酸緩沖液洗脫 10 次； 用10 支預先加入 100 μL pH7. 5 Tris-HCl 緩沖液的收集管收集洗脫液。為確保實驗效果，操作均在 4℃下進行。通過 BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白質進行定量，SDS-PAGE,考馬斯亮藍染色了解純化效果。
1. 2. 4 間接 ELISA 測定抗血清效價 以 1 mg / L 多肽 KLH 偶聯物 100 μL /孔包被96 孔酶標板，4℃過夜。滴加5 g/L BSA（160μL/孔） 37℃封閉 2 h.加入稀釋的純化多肽抗體、免抗血清或非免疫血清（100μL/孔），37℃孵育 1 h.滴加 HRP 標記的山羊抗兔 IgG（1∶3000），37℃孵育1 h; TMB 顯色液室溫避光顯色15 min,2 mol/L 硫酸終止顯色，測定樣品在450 nm 的吸光度（A）值。以 A抗血清/ A陰性> 2. 1 作為陽性判斷的依據1. 2. 5 Western blot 法鑒定 amelotin 多肽抗體的特異性 利用 RIPA 裂解液試劑盒制備成釉細胞總蛋白，用 2 × SDS 上樣緩沖液懸浮大腸桿菌中表達的小鼠 amelotin 融合蛋白（濰坊醫學院口腔醫學研究所實驗室制備儲存）、含有活性 amelotin的小鼠成釉細胞蛋白裂解液及 KLH,95℃加熱7 min 后，冰上冷卻 10 min.以 40 μg/孔的量進行上樣，經 SDS-PAGE 分離蛋白質，電轉至 PVDF 膜上。經50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉1 h后，滴加1∶1000 稀釋的純化多肽抗體，室溫孵育2 h.洗滌后，加入 HRP 標記的山羊抗兔 IgG（1∶5000），室溫孵育 1 h.ECLPlus 化學發光試劑盒處理 5 min,于暗室曝光到 X 光膠片上。
1. 2. 6 制備的 amelotin 多肽抗體的應用 免疫組織化學染色觀察 amelotin 在小鼠下頜中的表達。取出生后 3、7 d 昆明小鼠下頜骨組織，置于 100 mL/L 甲醛中，4℃ 固定 16 h; 經100 g / L EDTA 溶液 4℃ 脫鈣 6 d,常規制作石蠟切片。組織切片脫蠟入水，將切片于 pH 6. 0 檸檬酸鈉緩沖液中，95℃40 min進行抗原修復； 50 mL / L H2O2甲醇中 15 min 去除內源性過氧化物酶活性，滴加1∶50 的正常羊血清 37℃封閉 30 min;滴加純化兔抗 amelotin 多肽抗體（1∶50），同時以商品化的amelotin 抗體為對照，以非免疫血清為陰性對照，4℃ 孵育過夜，ABC 免疫組織化學檢測試劑盒進行檢測。DAB 顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果，以棕黃色染色判定為陽性結果。
2 結果
2. 1 Amelotin 的氨基酸序列分析
用在線蛋白工具對 amelotin 的蛋白質氨基酸序列進行分析，以避免制備的多肽抗體與其他同源蛋白之間的交叉反應，提高抗體的特異性。針對蛋白質的親水性、柔韌性、二級結構、抗原性及表面可及性等參數預測結果進行綜合研究，確定 amelotin 的第197 ~ 210 位的 14 個氨基酸 （ ATHTTEGTTIDPPN） 為需要合成的多肽序列（圖 1）。
2. 2 Amelotin 抗血清效價的測定及多肽抗體的純化
利用 amelotin 多肽 KLH 偶聯物為抗原免疫新西蘭大白兔，獲得兔抗血清，親和層析法對 amelotin 抗血清進行純化，經 SDS-PAGE 后條帶單一，BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測免疫 2 只大白兔獲得的抗體的濃度分別為 300 μg/mL 和 450 μg/mL,選用高濃度抗體進行下一步實驗（圖 2）。間接 ELISA 檢測表明免疫獲得的抗血清的效價可達到 1∶100 000,純化后的 amelotin 抗體效價可達 1∶1 000 000（圖 3）。
2. 3 Amelotin 多肽抗體的特異性鑒定以制備的小鼠 amelotin 大腸桿菌融合表達蛋白、含有活性 amelotin 的小鼠成釉細胞蛋白裂解液作為抗原，amelotin 多肽抗體為一抗進行 Western blot 法檢測，條帶 1 ~2 顯示多肽抗體與 amelotin 大腸桿菌融合表達蛋白相互作用，出現 1 條清晰的帶，與融合表達蛋白 amelotin 的 Mr大小相符； 條帶3 ~5 顯示與活性 amelotin 的成釉細胞蛋白裂解液相互作用，出現1 條清晰的目的條帶，與活性 amelotin 大小相符； 而與 KLH 相互作用則無條帶出現（圖 4）。說明所制備的抗體既可識別含有半抗原的抗原表位蛋白，又能與天然的 amelotin 蛋白結合。
2. 4 制備的多肽抗體檢測 amelotin 在小鼠下頜組織的表達
用純化的 amelotin 多肽抗體對 3、7 d 小鼠的下頜組織進行免疫組織化學染色，在 3、7 d 小鼠的磨牙釉質全層觀察到強陽性信號帶（圖 5A、B）。商品化 amelotin 抗體組僅在 7 d 小鼠磨牙釉質見到較弱的陽性信號，以非免疫血清代替一抗組未檢測到amelotin陽性表達信號（ 圖 5C、D） .另外，在 7 d 小鼠下頜下腺的導管上皮細胞的胞質中還觀察到amelotin的表達，而腺泡細胞則呈陰性反應，但 3 d 小鼠的下頜下腺中未見 amelotin 的表達（圖 5E、F）。
3 討論
Amelotin 是最近發現的一種新的與牙釉質的發育成熟有關的釉質基質蛋白，它定位于人的 4 號染色體 q13. 3 區域與釉蛋白（enamelin） 和成釉蛋白（ameloblastin） 緊密相連[12 - 14].Amelotin 在釉質分泌階段未見明顯表達，隨著釉質發育成熟 amelotin 在成釉細胞中的表達逐漸增加，可見此蛋白可能與牙釉質礦化過程有關聯[15 - 16].遺傳性釉質發育不全（amelogenesis imperfects,AI ）的致病基因定位于4q11-4q21 區域，而 amelotin 可能與 AI 的發生密切相關[17 -18].我們研究小組在 2009 年根據 amelotin 的全長氨基酸序列，構建了 pET32a-Amelotin 原核融合表達載體，根據重組融合蛋白制備了 amelotin 多克隆抗體[11],該方法制備的抗體特異性和效價已經無法滿足我們的實驗要求，為更好地研究 amelotin 的生理及病理特性，我們設計合成了 amelotin 多肽，之后制備了 amelotin 多肽多克隆抗體，經實驗證明該抗體特異性強、靈敏度高，該方法的優勢在于使用少量的多肽抗原即可獲得大量質量均一的特異性 amelotin 蛋白，經濟簡單。
通過對 amelotin 氨基酸序列的親水性、表面可及性、柔韌性、二級結構及抗原性等參數應用軟件綜合評價預測結果的分析[18],我們最終確定 amelotin 的第 197 ~210 位區域 14 個氨基酸作為其抗原決定簇。
同時在蛋白質數據庫中進行同源性檢索，驗證其特異性。為增加合成的小分子多肽的免疫原性，我們設計多肽時在其 C 端加 1 個半胱氨酸，并與載體KLH 偶聯。
通過 ELISA 和 Western blot 實驗，我們發現制備的 amelotin 多肽 KLH 具有很好的免疫原性，獲得的抗血清具有較高的效價，可達到1∶1 000 000,與我們以前制備的 amelotin 效價 1∶12 800 相比[11],抗體效價明顯提高，能夠滿足后續的實驗應用。并且制備的 amelotin 多肽抗體既能特異識別融合的蛋白，又能識別天然構象的蛋白，這表明我們利用所設計和合成的多肽制備的抗體是成功的。利用制備的多肽抗體進行的免疫組織化學染色，結果顯示 amelotin 在出生 3、7 d 小鼠的磨牙牙釉質中高表達，與我們之前利用重組融合蛋白的方法制備 amelotin 抗體的檢測結果一致[11],與商品化的 amelotin 抗體相比，特異性更高。另外，還在7 d 小鼠下頜下腺的導管上皮細胞的胞質中觀察到 amelotin 的表達，但 3 d 小鼠中未見表達。作為參與釉質發育成熟的特異性蛋白，為何在腺體中有所表達，并且表達量呈現時空特異性，是否 amelotin 也與腺體的發生分化及發育異常有關，還有待于進一步研究。以上實驗證明我們成功設計和合成了 amelotin 多肽片段，制備的多肽抗體效價高、特異性好，符合實驗要求。Amelotin 合成多肽及其抗體的成功制備，為下一步進行 amelotin 的分子功能及蛋白質組學研究打下很好的基礎。
參考文獻：
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