多 環 芳 烴 （polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs）是指由 2 個以上芳香環構成的化合物，主要由煤、石油等有機物的不完全燃燒產生。 飛機、汽車尾氣、城市排放的生活污水及工業廢水，甚至是油炸、熏制食品及食品包裝材料、玩具、輪胎等塑料橡膠制品中都含有大量的 PAHs[1-2]. 環境中許多種類的 PAHs及其代謝物對人類具有潛在的、持續的毒害作用[3-4].美國和歐盟分別將不同種類的 PAHs 規定為優先控制污染物并規定了限量要求[5-6],我國也頒布了國家標準嚴格限制飲用水、空氣、食品中苯并（a）芘的含量[7-9].

目前，PAHs 定量檢測最常用的方法是氣相色譜-質譜連 用法（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）和高效液相色譜法 （high performance liquidchromatography, HPLC），這類方法樣品前處理步驟繁瑣，檢測時間長，很難滿足大量樣品的快速篩查和檢測要求[10-11]. 國外很早就開始研究 PAHs 的免疫學檢測方法，并建立了 PAHs 酶聯免疫吸附（enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA） 分析方法 , 研究表明 ,ELISA 方法靈敏度高，操作簡便，可與儀器分析方法聯合應用，適合對大量樣品的快速篩選，實現 PAHs的現場監控[12-17]. 此前，國內也有少量的關于 PAHs 酶聯免疫方法的研究報道，但多采用多克隆抗體。 楊麗波等制備了抗萘多克隆抗體，建立了測定水中萘的ELISA 檢測方法[18]. 張彥峰等利用自制的多抗血清以間接競爭ELISA法，測定芘的IC50值為0.132mg/L,檢出限為 0.1 mg/L,但并沒有對抗血清進行純化，進一步優化建立完善的檢測方法[19].

本研究在前期成功制備了抗多環芳烴多克隆抗體的基礎上[20],制備了針對 PAHs 的 2 種單克隆抗體，并對其免疫學特性進行了研究，以期用于不同種類的 PAHs ELISA 檢測試劑盒的研制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Infinite M200 酶標儀 （TECAN），倒置顯微鏡（Olympus）。 USEPA 優先控制的 16 種 PAHs標準品購自百靈威公司。 辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG（IgG-HRP）購自 Jackson 公司。 弗氏不完全佐劑 、弗氏 完 全 佐 劑 、牛 血 清 白 蛋 白（bovine serumalbumin,BSA）、HAT 培養基 、3,3′，5,5′- 四甲基聯苯胺（3,3′，5,5′-Tetramethylbenzidine,TMB）購自于Sigma 公司。 PEG1500 為 Roche 公司產品；DMEM 培養基為 Gibco 公司產品；BCA 蛋白測定試劑盒由上海生工生產；抗體亞類測定試劑盒為 Southernbiotech（SBA）生產；Balb/c 雌性小鼠購于北京實驗動物研究中心。

1.2 人 工 抗 原 的 制 備 和 鑒 定 以 芘 丁 酸 （1 -pyrenebutyrate, PBA）為半抗原 ,采用活性酯法分別與 BSA 和 OVA 偶聯合成免疫抗原和包被抗原，具體方法參見文獻[20].

1.3 動物免疫 取 6~8 周齡雌性 Balb/c 小鼠，內眥取血，分離血清，作為陰性血清。 以 PBA-BSA（60 μg）與弗氏完全佐劑混合后，腹腔免疫。 2 周后，以 PBA-BSA（30 μg）加弗氏不完全佐劑再次腹腔免疫。 此后，每隔 2 周以 PBA-BSA（30 μg）加弗氏不完全佐劑強化免疫。 第 4 次免疫后 2 周，內眥取血，分離血清，以PBA-OVA 為包被抗原，間接 ELISA 檢測血清中抗體效價。 選擇抗體效價高的小鼠，以 PBA-BSA（50 μg）脾內加強免疫，3~4 d 后取其脾細胞做細胞融合。

1.4 細胞融合 將對數生長期的 Sp2/0 細胞與小鼠脾細胞按 1∶5 的比例混合，1 500 r/min 離心 5 min. 棄上清，輕彈管底使細胞充分散開。將離心管放入 37 ℃水浴中，1 min 內緩慢加入 1 ml 的 50% PEG,靜置 1 min,然后緩慢加入 2 ml 的無血清的 DMEM,1 500 r/min離心 5 min,棄上清，加入含 20%小牛血清的 HAT 選擇培養基，混勻后，接種于含有飼養細胞的 96 孔培養板中，置 37 ℃，5% CO2培養箱中培養。

1.5 雜交瘤細胞株的篩選與克隆 融合約 10 d 后，分別以 2 μg/ml“PBA-OVA”和“BSA”包被酶標板，間接ELISA 法檢測雜交瘤細胞的上清液。有限稀釋法對陽性雜交瘤細胞進行克隆化，擴大培養后，競爭 ELISA方法篩選分泌抗 PAHs 的單克隆抗體雜交瘤細胞株。

1.6 單克隆抗體的制備及純化 采用體內誘生腹水法制備單克隆抗體， 將腹水 5 000 r/min 離心 20 min除去細胞和其它沉淀物，硫酸銨-正辛酸初步純化后，采用 Protein G 親和層析的方法進一步純化。 BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白含量，SDS-PAGE 鑒定抗體純度。

1.7 抗體亞類測定 抗體亞類試劑盒檢測單克隆抗體亞類。

1.8 抗體親和常數測定 采用間接 ELISA 方法測定抗體效價和親和常數[21]. 以 “PBA-OVA”抗原按照2.5、1.25、0.625、0.312 5 μg/ml 包被酶標板，將單抗從200 倍開始倍比稀釋，以抗體質量濃度（mg/ml）的對數值為橫坐標，以其相對應的吸光度 A 值為縱坐標，繪制反應曲線。 找出各條曲線的 Amax和 50% Amax所對應的抗體質量濃度，根據式（1-1）計算出該株單抗的親和常數 Ka:Ka=（n-1）/2（n[Ab′]t-[Ab]t） （1-1）式中： n 為每組中 2 個包被濃度的倍數；[Ab′] t 和[Ab] t分別為每組中 2 個 50% Amax所對應的抗體質量濃度。

1.9 抗 體 特 異 性 與 交 叉 反 應 率 測 定 以 2 μg/mlPBA-OVA 為包被抗原，用 0.01 mol/L PBS 緩沖液將PBA 稀釋成不同質量濃度的標準溶液做為競爭抗原，競爭 ELISA 檢測抗體的特異性。 酶標儀雙波長（450 nm,630 nm）測定吸光度（A），按照式（1-2）計算不同濃度 PBA 對抗原抗體結合反應的抑制率：IC=[1-（A樣品-A空白）/（A0-A空白）]×100 （1-2）式中：IC-待測物對抗原抗體反應的抑制率（%）；A樣品-待測物標準液的平均 A 值；A0-待測物標準液濃度為 0 時的平均 A 值；A空白-不加入二抗及待測物標準液的平均 A 值。 以標準溶液濃度的對數值為橫坐標，抑制率 IC 為縱坐標繪制標準曲線。

PAHs 的種類在 100 種以上，本文以 USEPA 列出的水質中優先控制的 16 種多環芳烴為研究對象代替 PBA 按照上述方法測定各類 PAHs 的抑制中濃度 （IC50），以芘 IC50為參照，計算每種 PAHs IC50值與芘 IC50比值即為每種物質的交叉反應率（CR%），從而確定單克隆抗體對不同種類 PAHs 的交叉反應。