苦馬豆素\\( SW\\) 屬于吲哚里西啶生物堿,最早是從灰苦馬豆中分離得到的[1].研究發現,SW 是棘豆屬[2]、黃芪屬[3]等瘋草植物的主要有毒成分.瘋草在新疆地區分布廣泛,不利于該地區畜牧業的發展.
瘋草屬于豆科植物,除含有瘋草毒素外,還含有豐富為,SW 相對分子質量小,為半抗原,需要將 SW 與大分子載體蛋白\\( 如 BSA\\) 耦聯合成人工抗原\\( SW -BSA\\) ,然后用其免疫家畜,誘導產生特異性抗體,可使家畜獲得免疫力并在采食瘋草時得到保護.童德文等[8]用 SW - BSA 免疫莎能奶山羊,以甘肅棘豆作為攻毒飼草進行試驗,結果取得一定保護效果.在國內研究中,還未見用免疫方法預防新疆本地家畜瘋草中毒的研究報道.本試驗用合成的人工抗原免疫新疆特有和田羊,通過檢測血清特異性抗體水平和生化指標,分析 SW - BSA 對和田羊的免疫原性和安全性,以期為防治和田羊瘋草中毒奠定基礎.
1 材料.
1. 1 試驗動物.
和田羊 12 只,年齡為 2 歲左右,體重為\\( 28. 0 ±1. 2\\) kg,購自和田地區策勒縣.
1. 2 主要試劑.
SW - BSA,由新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室制備; 弗氏完全佐劑\\( FAC\\) 、弗氏不完全佐劑\\( FAI\\) ,購自 Sigma 公司; 谷草轉氨酶\\( AST\\) 、谷丙轉氨酶\\( ALT\\) 、乳酸脫氫酶\\( LDH\\) 、堿性磷酸酶\\( AKP\\) 、肌酐\\( CRE\\) 、α - 甘露糖苷酶\\( AMA\\) 檢測試劑盒,均購自南京建成生物工程研究所; 其余常規試劑均為國產分析純,試驗用水為超純水.
1. 3 主要儀器.
全波長酶標儀\\( 型號為 Power Wave XS\\) ,購自美國 Bio - tek 公司; 生化分析儀 \\( 型號為 Vet Test8008\\) 、離心機\\( 型號為 Stat Spin VT\\) ,購自北京安普生化科技有限公司; 精密電子天平\\( 型號為 BS124\\) ,購自德國 SARTORIUS 公司; 超純水系統\\( 型號為 Di-rect - Q3\\) ,購自美國 Millipore 公司; 高速冷凍離心機\\( 型號為 MR231\\) ,購自法國 Jouan 公司.
2 方法
2. 1 試驗動物處理.
試驗羊進入羊舍前,先用 84 消毒液對羊舍進行消毒,觀察 7 d,驅除試驗羊體表及體內寄生蟲,將試驗羊隨機分為對照組、試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組,每組 4只.試驗羊自由采食青干草,每只羊每日補飼精料300 g,分上午、下午 2 次飼喂,自由飲水.
2. 2 免疫試驗.
參照參考文獻[8]中的方法制備疫苗,使用 FAC對各試驗組羊進行基礎免疫,首免時用 FAC 和生理鹽水的混合液\\( 體積比為 1∶1\\) 充分乳化 SW - BSA;第 1 次和第 2 次加強免疫時用 FAI 和生理鹽水的混合液\\( 體積比為1∶1\\) 乳化 SW - BSA; 第3 次加強免疫時用生理鹽水乳化 SW - BSA.試驗組免疫劑量和次數見表 1.
2. 3 血清抗體效價的測定.
以首免為第0 天,在每次免疫前對試驗羊空腹靜脈采血,免疫結束后每隔 7 d 采血 1 次,共采血 10次.采用間接血凝試驗\\( IHA\\) 和間接酶聯免疫吸附試驗\\( ELISA\\) 檢測試驗羊血清抗體效價的變化.IHA條件參照參考文獻[8],紅細胞用 30 μg/L 的 SW 致敏.ELISA 條件參照參考文獻[9],測量樣品孔OD450值\\( P\\) 與陰性對照孔 OD450值\\( N\\) ,以 P/N >2. 1判定樣品為陽性.
2. 4 血清 E - 玫瑰花環試驗.
參照參考文獻[10]中的方法,計數 200 個淋巴細胞,凡 1 個淋巴細胞結合 3 個紅細胞或以上者為 1個玫瑰花環陽性細胞,計算玫瑰花環形成率.
2. 5 血清生化指標測定.
參照相應檢測試劑盒說明書測定血清中 AST、ALT、LDH、AKP、AMA、CRE 水平.
2. 6 體液中 SW 的定性檢測.
2. 6. 1 尿液中 SW 的定性檢測 在采血當日,對試驗羊進行人工采尿.參照參考文獻[11]中的方法分離結晶體,采用薄層層析法檢查尿液中是否含有SW.吸附劑為硅膠 GF254,展開劑為氯仿∶ 甲醇∶ 氨水∶水\\( 70∶26∶2∶2\\) ,采用上行法展開.若在薄層板比移值\\( Rf\\) 為 0. 48 左右處出現紫紅色斑點則判定為檢測到 SW,否則判定檢測液中不含 SW.
2. 6. 2 血液中 SW 的定性檢測 取試驗羊血清.
2 mL,加入純化水 1 mL,丙酮 6 mL,超聲處理10 min\\( 頻率為 50 Hz,溫度為 37 ℃\\) ,10 000 r/min 離心10 min后取上清液,重復上述步驟再處理沉淀物2 次,合并上清液,80 ℃ 水浴除去丙酮,最后冷凍干燥得到凍干物[12].該凍干物的檢測方法同 2. 6. 1.
2. 7 統計學分析.
應用 SPSS 11. 5 軟件中 One - Way ANOVA 方法對試驗數據進行單因素方差分析及鄧肯氏多重比較,檢驗誤差為 5%和 1%.
3 結果與分析.
3. 1 血清抗體效價的檢測結果.
所有試驗羊均在第 2 次加強免疫后產生了抗SW 抗體,經 IHA 和 ELISA 檢測,試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組抗體效價均為22; 第3 次加強免疫后血清抗體效價明顯升高,試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組最高抗體效價分別為26和 28; 試驗組抗體效價均在第 3 次加強免疫后第14 天\\( 第 6 次采血\\) 達到最高值,并在第 3 次加強免疫后第 35 天時\\( 第 9 次采血\\) 仍保持在較高水平.2個試驗組和田羊血清抗體變化趨勢較一致,但試驗Ⅱ組的抗體效價值始終高于試驗Ⅰ組; 對照組未檢測到抗 SW 抗體存在.結果見圖 1.
3. 2 血清 E - 玫瑰花環試驗結果整個免疫試驗期內試驗組和田羊血清 E - 玫瑰花環率呈上升趨勢,并在第 6 次采血時達到最高值,然后試驗組 E - 玫瑰花環率的變化趨勢趨于平緩.
從第 3 次采血開始,試驗Ⅱ組 E - 玫瑰花環率高于試驗Ⅰ組,到第 9 次采血時 2 個試驗組 E - 玫瑰花環率差異不顯著.對照組 E - 玫瑰花環率波動較為平緩,但均小于試驗組.結果見圖 2.
3. 3 血清生化指標測定結果.
整個試驗期內所有和田羊血清中 AST、ALT、LDH、AKP、AMA、CRE 水平均在正常范圍內[13],且試驗組與對照組之間差異不顯著.結果見圖 3、圖 4、圖 5.
3. 4 試驗羊體液中 SW 的定性檢測結果.
從第 1 次采血、采尿開始,到第 10 次時,試驗組和田羊的尿液和血液中均未檢測到有 SW.
4 討論.
人工抗原免疫家畜能否產生抗體,不僅與人工抗原的質量和免疫動物個體狀況有關,還與免疫程序有關.在一定范圍內抗原劑量與免疫反應強度呈正相關,過低與過高都不利于抗體的產生.試驗初期使用小劑量抗原免疫家畜,一方面考慮 SW 抗原決定簇較少,另一方面是因為小劑量可以激活高親和力的淋巴細胞; 后期大劑量免疫則是考慮維持已經產生的抗體和進一步激活更多的淋巴細胞.與童德文等[8]的研究結果相比,本試驗抗 SW 抗體效價的產生時間和周期較為一致,而加強免疫后的 28 d 內抗體效價高于童德文等人的報道,說明本試驗免疫劑量和時間的設計是合理的.E - 玫瑰花環率的變化反映了動物機體免疫力的變化[10],其中主要受 T 淋巴細胞的影響.試驗組前期 E - 玫瑰花環率上升,可能是因為人工抗原刺激動物機體免疫細胞表達,從而產生了大量高活性的 T淋巴細胞,導致 E - 玫瑰花環率的增加,說明該免疫反應可以有效阻止進入機體的 SW 侵害動物的免疫系統.試驗中雖然檢測到和田羊血清中出現抗 SW抗體,但該抗體能否保護和田羊在采食瘋草時免于中毒,還有待于進一步研究證實.
SW 為半抗原,不具有完全的免疫原性,只有將其耦聯到大分子載體上才能誘導出免疫原性[8].在研究 SW 人工抗原的免疫原性時,需要分析臨床病理學指標,檢測 SW 人工抗原免疫動物時對機體肝臟、腎臟功能的影響,探討其對動物機體組織器官的影響,并監測尿液和血液中有無 SW 存在.AST、ALT、AKP 和 LDH 等酶主要分布于肝臟、心臟、骨骼肌等器官和組織,當臟器細胞的完整性遭到損害時,這些酶就逸入細胞外周的組織液,繼而到達血液.因此,通過檢測血液中這些酶的活性,可以在一定程度上反映器官細胞的受損狀況[14],其中 AKP 是家畜瘋草中毒后活性最早發生改變的,是極具有診斷意義的一種酶,AST 和 ALT 是肝臟受到損傷的參考依據,LDH 值的急速升高說明機體發生急性肝細胞、骨骼肌和心肌損傷.抗線粒體抗體在機體低聚糖代謝中起著重要作用,國內外研究結果表明,SW 對 AMA 具有強烈的和特異性的抑制作用[7].血肌酐是肌酸代謝終產物,血液中血肌酐含量的變化可反映腎臟排氮功能的變化,對于判定腎臟損傷程度具有重要意義.本試驗中,和田羊在 50 d 的免疫試驗和 42 d 的后續觀察中均未發現血清酶指標發生特異性變化,尿液檢測和血液檢測均未發現機體中有 SW 單體,說明合成的SW - BSA 具有較好的免疫安全性.
綜上所述,用 SW - BSA 免疫接種和田羊后可產生高效價的抗 SW 抗體,血清 AST、ALT、AKP、AMA、LDH 和 CRE 水平均在正常范圍內,尿液和血液中未檢測到 SW.說明 SW -BSA 可以在和田羊中安全應用.
參考文獻:
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