肺孢子菌肺炎\\( Pneumocystis pneumonia,PC\\) 是各種先天或后天免疫機能低下者常見的并發癥和主要的死亡原因之一.復方磺胺甲 唑作為目前預防和治療 PCP 的主要藥物,由于其毒副作用及耐藥性問題受到了一定程度限制.因此,尋找更為安全及有效的防治措施成為目前研究 PCP 的一個焦點.
P55 抗原是肺孢子菌細胞壁分子量為 45 ~ 55kD 的組分抗原,它能刺激宿主產生保護性免疫反應[1].Ma 等[2]發現 p55 抗原基因存在多態性并克隆了 p55-v1 ~4 抗原基因,并將 Smulian 等[3]克隆的p55 抗原基因命名為 p55-v0,比較發現 p55-v3 與p55-v0 在結構和染色體位置上均存在差異.本課題組前期已成功克隆出 p55-v3 與 p55-v0 抗原基因,序列 比 對 發 現 p55-v3 和 p55-v0 同 源 性 僅 為20. 9%[4].那么機體感染 PC 過程中,p55-v3 能否刺激宿主產生保護性免疫反應,尚無研究證實.本研究在成功構建 PC DNA 疫苗 pVAX-p55-v3 及pVAX-p55-v0 基礎上[5],免疫 SD 大鼠并誘導 PC 感染,比較觀察肺重/體重、肺印片包囊計數及組織病理學,從而對 p55-v3 抗原的免疫保護作用提供依據.
1 材料與方法
1. 1 主要試劑、質粒及菌株 質粒抽提試劑盒\\( 大抽\\) 購自 Omega 公司.感受態大腸桿菌 DH5α 購自北京 鼎 國 生 物 技 術 有 限 公 司.真 核 表 達 載 體pVAX1 購 自 Invitrogen 公 司. pVAX-p55-v3 及pVAX-p55-v0 由本實驗室自制.
1. 2 質粒的抽提 \\( 大抽\\) 挑取 pVAX-p55-v3、pVAX-p55-v0、pVAX1 單菌落,分別接種于 LB / Kna培養基中,按質粒抽提試劑盒\\( 大抽\\) 說明書進行抽提,核酸蛋白分析儀測定質粒濃度及純度.
1. 3 動物免疫 40 只 SD 雌性大鼠,分為 4 組\\( A組 PBS 對照組、B 組 pVAX1 免疫組、C 組 pVAX-p55-v0 免疫組、D 組 pVAX-p55-v3 免疫組\\) ,分別肌肉注射 DNA 疫苗100 μg,每15 天免疫1 次,共免疫4 次.末次免疫 15 d 后,按照文獻[6]報道建立PCP 動物模型,誘導 PC 感染.
1. 4 療效考核 實驗前后均記錄各組大鼠體重.
實驗完畢,處死大鼠,取肺分離氣管及肺門組織,吸干表面水分后稱全肺濕重.將每只大鼠的 4 個肺葉上下橫斷,印于 5 張載玻片上印片,每張印片編號.空氣干燥,甲醇固定,六亞甲基四胺銀\\( GMS\\) 染色,油鏡下順序觀察 100 視野,計數 PC 包囊數,計算每視野包囊均數,再計算每組包囊均數.取左肺上部分小塊組織,10%甲醛固定,石蠟包埋,制成切片,經 HE 和 GMS 染色后觀察.參照 Kim等[7]提供的方法,按所涉及的肺泡數確定 PC 感染的程度.
1. 5 統計學分析 實驗數據用 x-± s 表示,組間數據結果分析采用單因素方差分析,使用 SPSS10. 0 統計學軟件進行分析,P <0. 05為統計學差異顯著.
2 結果
2. 1 大鼠體重及肺重 /體重的變化 地塞米松注射6 周后,pVAX-p55-v3 及 pVAX-p55-v0 免疫組體重增加,肺重\\( g\\) /體重\\( g\\) 明顯降低\\( 0. 96 ± 0. 15/0. 83 ± 0. 14 vs 1. 59 ± 0. 32 /1. 68 ± 0. 38\\) ,P < 0. 05,而 pVAX-p55-v3 組與 pVAX-p55-v0 組無顯著性差異\\( P >0. 05\\) .
2. 2 肺印 片 包 囊 均 數 比 較 pVAX-p55-v0 及pVAX-p55-v3 免疫組每視野包囊均數明顯低于pVAX1 及 PBS 對照組\\( 0. 95 ± 0. 45、1. 75 ± 0. 98 vs5. 76 ± 1. 42、5. 90 ± 1. 03\\) ,P < 0. 05.從圖 1A ~ C、d 亦可見 pVAX-p55-v0 及 pVAX-p55-v3 免疫組包囊數明顯減少.
2. 3 肺組織病理學觀察
2. 3. 1 HE 染色 pVAX-p55-v0 及 pVAX-p55-v3 免疫組肺切片\\( HE 染色\\) ,肺實變較對照組明顯減輕,肺泡腔內滲出減少,見圖 1E、F、G、H.
2. 3. 2 GMS 染色 采用 GMS 染色,PBS 及 pVAX1對照組 \\( 圖 1I、J\\) 肺切片可見被染成棕黑-黑色的PC 包囊散在或成堆地存在于肺泡腔中或貼在肺泡壁上,肺泡間質中亦可見少量包囊.而實驗組包囊數量均明顯減少\\( 圖 1K、I\\) .
3 討論
P55 是卡氏肺孢子菌細胞壁上的一種組分抗原.Smulian 等[1,3]克隆并鑒定了肺孢子菌 55 kD抗原基因\\( p55-v0\\) ,將重組 P55 抗原主動免疫大鼠后能夠刺激機體產生體液和細胞免疫反應.Ma等[2]
分別克隆了 p55-v1 ~ v4 基因,比較發現 p55-v3和 p55-v0 基因 3‘端均為高度保守區域,但兩者重復區域的氨基酸種類和數目存在差異; p55-v0 包含一個 N-連接糖基化位點和 RGD 連接位點而 p55-v3沒有; 染色體雜交發現 p55-v3 位于第 4 染色體而p55-v0 位于第 2 染色體.本課題組前期成功構建pVAX-p55-v3 及 pVAX-p55-v0 DNA 疫苗,進一步免疫 SD 大鼠發現 p55-v0 具有部分免疫保護作用,與Smulian等[1]
及易亮衡等[8]的報道一致.同時亦觀察到,與 p55-v0 相似,p55-v3 組蟲體負荷明顯減少,且 p55-v3 組病理切片可見肺泡間隔水腫明顯減輕,炎癥細胞減少,提示 p55-v3 同樣能提供部分保護作用,這為后續進一步對 p55-v3 免疫保護作用機制研究提供基礎,亦為 PCP 的防治提供一種新的方法和手段.
參考文獻:
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[2] Ma L,Kutty G,Jia Q,et al. Characterization of variants of thegene encoding the p55 antigen in Pneumocystis from rats and mice[J]. J Med Microbio,2003,52\\( Pt11\\) : 955-960.
[3] Smulian AG,Theus SA,Denko N,et al. A 55 kDa antigen ofPneumocystis carinii: analysis of the cellular immune response andcharacterization of the gene[J]. Mole Microbiol,1993,7\\( 5\\) : 745-753.
[4] 馮燕梅,羅永艾,江 濤. 卡氏肺孢子菌 p55-v0 及 p55-v3 基因 CDS 區的克隆與序列比較[J]. 中國人獸共患病學報,2010,26\\( 3\\) : 235-238,242.
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[7] Kim CK,Foy JM,Cushion MT,et al. Comparison of histologicand quantitative techniques in evaluation of therapy for experimen-tal Pneumocystis carinii pneumonia[J]. Antimicrob Agents Che-mother,1987,31\\( 2\\) : 197-201.
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