降鈣素基因相關肽是一種由 37 個氨基酸殘基組成的神經肽,屬于降鈣素基因相關肽家族[1].它是和降鈣素\\( Calcitonin,CT\\) 在不同組織中由同一基因在進行基因重組后形成,在心臟和神經系統中主要轉錄表達成 CGRP,而在甲狀腺主要轉錄表達成 CT.人類的 CGRP 有 α 和 β 兩種分子形式,且都有生物活性.CGRP 廣泛存在于中樞和外周神經系統中,并通過激活細胞膜上的 CGRP 受體的結合位點從而激活腺苷酸環化酶,促使細胞內 cAMP 水平升高而產生多種生理作用,如感覺、心血管活動、運動、睡眠、呼吸、體溫調節等[2-5].同時,利用免疫組織化學觀察到在硬腦膜上有大量的 CGRP 免疫反應性的神經纖維存在[6].有研究表明,側腦室注射CGRP 能明顯抑制壓力的感受性反射[7],表明 CGRP在大鼠側腦室內具有鎮痛作用.脊髓以上水平,在多個與痛覺密切相關的腦區內,如中腦導水管周圍灰質\\( Periaqueductal gray,PAG\\) 、中縫大核\\( Nucleusraphe magnus,NRM \\) 、伏核 \\( NAc \\) 和中央杏仁核\\( Central nucleus of amygdale,CeA\\) 等 都 發 現 過CGRP 及其受體[8-10].韁核\\( Habenular complexes,Hb\\) 是在鎮痛作用中非常重要的核團,存在于脊椎動物的背側間腦,可分為內側韁核\\( Medial habenular complex,MHb\\) 和外側韁核\\( Lateral habenular complex,LHb\\)[11-13],而且 LHb 是杏仁核、海馬、視前區等邊緣系統到中腦的樞紐.有關 CGRP 在 LHb 內對大鼠痛覺調節的影響國內外尚未見報道,因此本實驗通過對大鼠的LHb 微量注射 CGRP,采用熱板和壓板測痛儀來測量大鼠對傷害性熱刺激和機械刺激所引起的 HWL,并將其作為衡量大鼠痛覺的指標,進而分析 CGRP參與 LHb 對痛覺的調節作用,可以為揭示 CGRP 在脊髓水平以上的中樞神經系統內鎮痛作用的機制提供新的位點,并為 CGRP 受體激動劑和拮抗劑的臨床應用提供依據.

1 材料與方法

1. 1 實驗材料

1. 1. 1 動物 實驗動物選用成年雄性 Wistar 大鼠\\( 由吉林大學白求恩醫學院動物中心提供\\) 8 只,體重均在 180 ~250 g 之間,實驗期間分籠飼養,自然光照,自由飲水與進食,飼養溫度 16 ~24℃.

1. 1. 2 試劑與藥品 降鈣素基因相關肽\\( 上海強耀生物科技有限公司提供\\) 用生理鹽水配置成濃度為 0. 875、1. 75、3. 5 和 7 nmol/μl,10% 水合氯醛,醫用酒精,H2O2,亞甲基藍,牙托粉和牙脫水等.

1. 1. 3 實驗器材 智能熱板儀\\( YLS-6B\\) ,電子壓痛儀\\( LYS-3E\\) ,均由安徽淮北正華生物儀器設備有限公司生產.手術器械、注射器、腦立體定位儀\\( 深圳瑞沃德公司生產\\) .

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 實驗前期工作 為了使大鼠熟悉測試環境,并減小實驗誤差,在實驗開始之前需要對大鼠進行熱板和壓力測試訓練.依據孫衍剛等[13]給出的實驗方法,訓練進行 5 d,每天5 輪,每輪3 次.經過訓練后大鼠的 HWL 會維持在一個比較穩定的范圍,熱板測試大約為 3 ~ 5 s 之間,壓力測試大約為5 ~7 s 之間.

1. 2. 2 核團微量注射 用水合氯醛腹腔麻醉,將大鼠的頭部水平固定在腦立體定位儀上,暴露頭骨,參考Watson 鼠圖譜在外側韁核定位,將不銹鋼套管插入,用牙托粉和牙脫水固定,封住套管和顱骨之間的縫隙.手術后恢復2 ~3 d 后進行行為痛覺測試.進行核團微量注射前,將注射器插入套管,緩慢注射藥物,每次注射后應讓注射針在管里停留片刻再將之取出.

1. 2. 3 行為痛覺測試 熱板測試: 熱板的溫度維持在 52℃\\( 51. 7℃ ~52. 3℃\\) ,將大鼠的待測后爪緊貼于熱板上,并開始計時,待大鼠后爪感覺到疼痛,主動回縮離開熱板時停止計時.記錄注射 CGRP 和注射生理鹽水對照組大鼠的 HWL.壓力測試: 使用壓力測痛儀對大鼠進行壓力測試,用腳踩住開關,使小楔形有機玻璃壓在鼠爪的跗跖關節處,待大鼠后爪感覺到疼痛時,會往回收縮,此時停止計時,記錄注射 CGRP 和注射生理鹽水對照組大鼠的 HWL.

1. 3 統計學數據處理 實驗所得的數據均以 x-± s形式表示,組間對比用獨立樣本 t 檢驗的方法進行統計處理.P < 0. 05,P < 0. 01,P < 0. 001表示統計結果具有顯著差異性.

2 結果

2. 1 LHb 內微 量濃度為 0. 875、1. 75、3. 5 和7 nmol / μl的 CGRP 的結果見表 1 ~ 4.實驗結果表明,LHb 內微量注射 0. 875 nmol/μl CGRP 組與對照組相比大鼠左爪熱刺激 HWL 有差異\\( P <0. 05\\) ,對大鼠右爪熱刺激 HWL 有顯著差異\\( P < 0. 001\\) ,見表 1; 微量注射濃度為 1. 75、3. 5 和 7 nmol/μl CGRP與對照組相比引起大鼠左、右爪熱刺激 HWL 有顯著性差異\\( P <0. 001\\) ,見表2 ~4.LHb 內微量注射0. 875 nmol / μl CGRP 與對照組相比大鼠左爪機械刺激 HWL 有顯著差異\\( P <0. 001\\) ,而對大鼠右爪機械刺激 HWL 無差異\\( P >0. 05\\) 見表 1; 微量注射濃度為 1. 75、3. 5 和 7 nmol/μl CGRP 組與對照組相比引起大鼠左、右爪機械刺激 HWL 有顯著性差異\\( P <0. 001\\) ,見表 2 ~4.即 LHb 內微量注射 CGRP可以引起明顯的鎮痛作用.

2. 2 CGRP 對正常大鼠的鎮痛作用具有劑量依賴性,且在 20 min 時鎮痛效果最為明顯,如圖 1 所示.

3 討論

目前應用于臨床的鎮痛藥物多為嗎啡、杜冷丁等阿片類藥物,在讓病人忘記疼痛的同時,也會產生耐藥性以及成癮性[14-16].因此,研究新型鎮痛藥物具有重要的生理學意義.而 CGRP 作為一種新型的神經肽,在體內分布廣,功能多,并且可以避免阿片類藥物的成癮性等副作用,研究其在中樞水平的鎮痛作用,在臨床具有十分廣闊的意義.

本實驗采用對大鼠 LHb 分別微量注射 CGRP\\( 用生理鹽水配置\\) 和生理鹽水的方法,來探討CGRP 對大鼠痛覺的調節作用.結果表明,注射CGRP 組的大鼠與注射生理鹽水組的大鼠相比,HWL 明顯增加,說明 CGRP 在大鼠的 LHb 起到了鎮痛作用,并且這種鎮痛效果在 20 min 左右最為明顯,具有時間上的規律性.

此外,有學者研究 CGRP 在大鼠扣帶束及周圍皮質對傷害性刺激反應的作用,結果表明注射一定劑量的 CGRP 能顯著降低大鼠對機械刺激的 HWL,使大鼠對熱板和機械壓力刺激產生痛敏反應,同樣有研究表明,在腦內某些核團微量注射 CGRP 均能延長大鼠的 HWL 值,如中腦導水管周圍灰質、側腦室等[7,8,17].這是因為降鈣素基因相關肽所在部位不同,與其不同受體結合導致的作用結果可能會不一樣所致.在實驗中還發現,對大鼠 LHb 微量注射4 個不同濃度 \\( 0. 875、1. 75、3. 5 和 7 nmol / μl\\) 的CGRP 作用效果不同,大鼠的后爪縮爪反應潛伏期也有顯著差異.通過觀察圖表,可以得出結論,隨著注射 CGRP 濃度的逐漸增加,大鼠的 HWL 也逐漸增加,說明 CGRP 具有鎮痛作用且具有劑量依賴性.

根據不同的藥理學特征,可以將 CGRP 受體分為兩類,即 CGRP1 受體和 CGRP2 受體.有研究表明,CGRP2 受體 可 被 CGRP 所 激 動[3-8],但 是 對CGRP8-37 的拮抗作用不明顯; 而相反的 CGRP1 受體對 CGRP8-37 的阻斷效應較為敏感,但是高劑量的 GGRP8-37 也可以成為受體的激動劑[17].同時,Bartho 等[18]也發現 CGRP 受體的阻斷劑 CGRP8-37可以部分逆轉由辣椒素所誘導的痛覺過敏及異常疼痛[19].但 CGRP 在 LHb 對大鼠的鎮痛作用機制尚不十分清楚,有待于一步的探討研究.

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