亞洲帶絳蟲\\(Taenia asiatica\\)感染在我國西部農牧地區存在局部流行,由于其病原體主要通過人生食受感染的豬肝或野豬等動物的內臟進入人體,危害極大。目前,針對亞洲帶絳蟲感染的預防主要采取綜合防治措施,尚未見應用疫苗預防亞洲帶絳蟲感染的報道。本研究通過觀察乳豬接種UV致弱六鉤蚴后血清IgG、脾淋巴細胞分泌細胞因子變化及蟲卵攻擊感染試驗,探討UV致弱六鉤蚴誘導的免疫保護力,為應用疫苗預防亞洲帶絳蟲感染提供理論依據。
材料與方法
1．實驗動物20d齡杜洛克長白三元雜交乳豬,11頭,購自都勻市種豬繁殖場,經糞檢、驅蟲和間接血凝試驗證明無囊尾蚴感染。
2．亞洲帶絳蟲采集以口服檳榔、南瓜子法,對貴州省都勻市絳蟲病流行區2例已確診絳蟲病患者進行驅蟲,剖開孕節子宮,以3 000r/min\\(離心半徑13.5cm\\)離心15min收集蟲卵,用生理鹽水調節蟲卵濃度為15萬個/ml。
3． UV致弱六鉤蚴制備采用次氯酸鈉法孵化六鉤蚴,并將六鉤蚴收集于培養皿中,置15W\\(253.7nm\\)紫外燈下30cm處照射10min,調節六鉤蚴濃度為2.5×104萬個/ml。
4．動物免疫取7頭免疫乳豬,沿耳緣靜脈注射UV致弱六鉤蚴懸液2ml/頭,第25d加強免疫1次\\(1ml/頭\\),每次免疫后第10d采血5ml。第35d處理3頭,觀察肝臟囊尾蚴寄生情況,收集脾臟,做脾淋巴細胞分離培養,其余4頭做蟲卵攻擊感染試驗。
5．蟲卵攻擊感染及實驗分組將上述免疫的4頭乳豬作為免疫組,未免疫正常乳豬4頭作為感染對照組,兩組均以灌胃方法感染蟲卵15萬個/頭。于感染第15d和45d分別處理乳豬2頭,比較兩組肝臟囊尾蚴總數、未成熟囊尾蚴數、成熟囊尾蚴數及退化/鈣化的囊尾蚴數,同時計算減蟲率。
6．乳豬脾細胞分離培養將上述收集的乳豬脾臟用無菌鑷子夾碎,制備無菌細胞懸液,移入無菌試管。另取一只無菌試管,先加淋巴細胞分離液,在緩慢將制備的脾細胞懸液加入試管中,分離液和細胞懸液體積比為1︰2,以1 500r/min\\(離心半徑13.5cm\\)離心20min,吸出單個核細胞層,用PBS洗滌2次,用10%1640細胞培養液重懸,調整細胞濃度至2×106/ml。于96孔培養板中加上述脾細胞懸液100μl/孔,免疫組和正常組各6孔。每組取3孔加終濃度為5μg/ml刀豆蛋白A\\(Con A\\),另3孔為對照孔不加刺激物,于37℃、5%CO2培養24h,收集上清,-20℃保存備用。
7．血清細胞因子檢測以夾心ELISA法測定脾淋巴細胞培養上清INF-γ和IL-4含量,操作步驟按試劑盒說明 書進 行,用Biorad 450酶標檢測儀\\(美國Bio Rad公司生產\\)測450nm處吸光度\\(A\\)值。INF-γ和IL-4試劑盒購自浙大生物基因工程有限公司\\(美國Rapid BioLab公司產品,分裝\\)。
8．血清特異性IgG檢測豬血清特異IgG含量以夾心ELISA法檢測,操作步驟按試劑盒說明書進行,用Biorad 450酶標檢測儀測450nm處吸光度\\(A\\)值。豬IgG檢測ElISA試劑盒購自上海彩佑實業有限公司。
9．統計分析用統計軟件Graghpad對觀察指標進行t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。
結果
1．乳豬接種UV-致弱六鉤蚴后的健康狀況3頭乳豬沿耳緣靜脈接種UV-致弱的六鉤蚴后體溫未見升高,飲食正常。第35d處理乳豬,肝臟未見囊尾蚴寄生。
2．乳豬接種UV-致弱六鉤蚴后血清特異性IgG水平乳豬接種UV-致弱六鉤蚴第10d和35d,血清特異性IgG含量為\\(34.4±5.02\\)mg/ml,與免疫前\\(13.7±4.37\\)mg/ml相比差異有統計學意義\\(t=9.312,P<0.05\\)。
3．乳豬接種UV-致弱的六鉤蚴后脾淋巴細胞分泌細胞因子水平變化脾淋巴細胞體外培養24h后,免疫組上清IL-4含量為\\(39.65±15.3\\)pg/ml,與正常對照組\\(15.8±7.5\\)mg/ml比較差異有統計學意義\\(F=10.45,P<0.05\\);經ConA刺激體外培養24h后,免疫組上清IL-4含量為\\(156.94±11.81\\)pg/ml,與正常對照組\\(80.6±13.5\\)mg/ml比較差異有統計學意義\\(F=12.82,P<0.05\\);脾淋巴細胞體外培養24h后,免疫組上清INF-γ含量與正常對照組含量比較差異無統計學意義\\(F=2.45,P>0.05\\),經ConA刺激體外培養24h后,兩組INF-γ含量均上升,分別為\\(416.18±24.62\\)pg/ml和\\(327.27±79.34\\)pg/ml,但差異無統計學意義\\(F=7.17,P>0.05\\)\\(圖2、3\\)。
4．免疫乳豬蟲卵攻擊感染后肝臟囊尾蚴回收情況蟲卵攻擊感染第15d和45d,免疫乳豬肝臟分別收集囊尾蚴178個和13個,未免疫乳豬分別收集305個和106個,免疫乳豬第15d和45d肝臟減蟲率分別為41.64%和87.73%。
5．免疫乳豬蟲卵攻擊感染后肝臟囊尾蚴發育情況在攻擊感染第15d,免疫乳豬共收集囊尾蚴總數為178個,其中未成熟囊尾蚴數77個,退化或鈣化囊尾蚴數101個,未見成熟囊尾蚴;未免疫乳豬退化/鈣化囊尾蚴和未成熟囊尾蚴數分別為205個和100個。攻擊感染后第45d,免疫乳豬共收集囊尾蚴13個,均為退化或鈣化囊尾蚴,未見成熟囊尾蚴,感染對照組未成熟、成熟及退化/鈣化囊尾蚴分別為25、38和43個。免疫乳豬囊尾蚴總數遠低于感染對照組\\(P<0.01\\)。
討論
在人體抵抗帶絳蟲感染中,體液免疫和細胞免疫均發揮著重要作用。呂芳麗等報道,UV致弱日本血吸蟲尾蚴可誘導小鼠產生較高水平特異性IgG,接種UV致弱尾蚴小鼠能預防日本血吸蟲感染。本實驗以紫外線\\(UV\\)輻照的方法制備亞洲帶絳蟲六鉤蚴疫苗,沿乳豬耳緣靜脈免疫乳豬,結果顯示免疫乳豬第35d血清特異性IgG為\\(34.4±5.02\\)mg/ml,顯著高于免疫前。提示亞洲帶絳蟲六鉤蚴體內含有重要保護性抗原,可誘導乳豬產生較強的體液免疫應答。
疫苗誘生的抗感染免疫與Th1/Th2型免疫應答密切有關。Th1細胞主要分泌IL-2、IFN- γ和TNF-β等細胞因子,促進細胞免疫應答,Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-13,促進體液免疫應答。
為了闡明UV致弱亞洲帶絳蟲六鉤蚴疫苗誘導乳豬Th1/Th2型細胞免疫應答情況,本研究通過檢測脾淋巴細胞分泌IL-4水平分析誘導的Th2型細胞應答,通過檢測INF-γ水平分析誘導的Th1型細胞應答。結果顯示,免疫組脾臟淋巴細胞體外培養24h后IL-4含量顯著高于正常對照組,經刀豆蛋白A\\(ConA\\)刺激體外培養24h后IL-4含量顯著高于正常對照組,說明Th2型細胞應答在亞洲帶絳蟲六鉤蚴疫苗誘導乳豬免疫保護中發揮重要作用。脾臟淋巴細胞體外培養24h后INF-γ含量和正常對照組相比差異無統計學意義\\(P>0.05\\),經ConA刺激體外培養24h后盡管兩組IL-4含量均升高,但差異仍無統計學意義\\(P>0.05\\),說明Th1型細胞應答在亞洲帶絳蟲六鉤蚴疫苗誘導的免疫保護中處于低應答狀態。
在蟲卵攻擊感染試驗中多以減蟲率和減卵率來評價尾蚴疫苗免疫效果。由于亞洲帶絳蟲感染中間宿主家豬后,囊尾蚴主要寄生在肝臟,其他臟器尚未發現有囊尾蚴寄生,因此,本研究以肝臟囊尾蚴回收及發育情況來評價UV-致弱六鉤蚴疫苗免疫效果。
結果顯示,在蟲卵攻擊感染第15d,寄生在免疫乳豬肝臟的囊尾蚴總數為178個,未成熟囊尾蚴數77個,退化或鈣化囊尾蚴數101個,未見成熟囊尾蚴,同未免疫組相比,回收的囊尾蚴總數和未成熟囊尾蚴數均減少;在攻擊感染第45d,寄生在免疫乳豬肝臟的囊尾蚴總數僅為13個,均為退化或鈣化囊尾蚴,未見成熟囊尾蚴。由此可見,接種UV致弱亞洲牛帶絳蟲六鉤蚴疫苗可預防乳豬亞洲帶絳蟲感染。
目前,有關亞洲帶絳蟲抗感染免疫研究尚處于摸索階段,本研究僅從UV致弱六鉤蚴疫苗免疫乳豬后血清IgG含量變化、Th1/Th2型細胞免疫應答狀況及蟲卵攻擊感染等試驗證實六鉤蚴體內含有重要保護性抗原,有必要采用蛋白組學和基因工程等技術從亞洲帶絳蟲六鉤蚴體內挖掘有潛力的保護性抗原,并克隆相關基因,這對于預防亞洲帶絳蟲感染具有重要意義。
參考文獻：
[1] 包懷恩.國亞洲牛帶絳蟲研究的現狀和展望[J].熱帶醫學雜志,2002,2\\(3\\):215-99.
