布氏菌?。˙rucellosis，簡稱布?。┦遣际暇鸬哪軌蛟谌撕蛣游镏袀鞑サ囊活惾双F共患病。布氏菌具有侵襲力強、傳染途徑多、引起多器官損傷的特點。家畜感染后如果得不到良好的治療可引發母畜流產和不育，人感染則主要引起波浪熱和轉化為慢性感染。據調查，全球已有 170 多個國家和地區有布病發生和流行。而我國 28 個省市區的人、畜有布病存在和流行，每年造成近千萬元損失。

疫苗接種是防治布病最有效、最經濟的手段。

布氏疫苗主要包括滅活苗、減毒活疫苗、菌體組分疫苗以及現在熱門研究的基因疫苗和重組蛋白疫苗等。目前，我國采用的人用布氏菌活疫苗為牛種弱毒株 104M 菌株，接種方式為皮上劃痕。該方法操作復雜、不能定量接種，人群接種陽轉率低，保護效果有限，被接種者因劃痕產生疼痛而不易被接受，從而影響疫苗的廣泛使用。鑒于布病疫情控制的需要，我們采用具有經濟性好和安全性高的皮內注射接種方式替代傳統的皮上劃痕。本次研究以小鼠為動物模型，采用皮內注射方式免疫，從體液免疫、細胞免疫和保護力試驗三個方面的結果全面評價疫苗的免疫原性和免疫保護效果。

1、 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 動物 SPF 級 BALB/c 小鼠，6 ~ 8 周，白色雌性，共 30 只，由中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2009-0017，飼養于中檢院清潔級動物室。

1.1.2 菌種 皮下注射用布氏菌活疫苗及羊布氏菌 M5 弱毒株均由中檢院結核病疫苗室提供。

1.1.3 實驗儀器 Bio-II-A 生物安全柜購自西班牙 Telstar 公司；Dragon-MK3 酶標儀購自芬蘭Labsystems 公司；DH6000 AB 型恒溫培養箱購自天津市泰斯特儀器公司；高速離心機購自德國Eppendorf 公司；酶聯斑點分析儀購于美國 CTL公司；CO2培養箱購于美國 Napco 公司；加樣槍購于 Gilson 公司。

1.1.4 試劑耗材 牛血清白蛋白和 ConA 購自美國 Sigma 公司；小鼠 IFN-γ 酶聯免疫試劑盒購自美國 BD 公司；達優-淋巴細胞分離液、無血清培養基、IFN-γ 及 IL-4 ELISA 預包被試劑盒均購自達科為生物技術公司；堿性磷酸酶標記羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a 購自美國 Bethyl 公司；pNPP 底物顯色液購自美國 SurModics 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及免疫 將 30 只 BALB/c 小鼠隨機分成 3 組，每組 10 只，分別為低劑量組（5 ×107/只），高劑量組（2 × 108/只），生理鹽水對照組，3 組均為后肢皮下注射，劑量為 0.2 ml/只。

1.2.2 動物血清和脾臟淋巴細胞的制備 免疫4 周后，對每只小鼠進行摘眼球取血，分離血清，–20 ℃ 保存，用于 ELISA 體液免疫檢測。將每只動物無菌取出的脾臟放在篩網上，滴加淋巴細胞分離液研磨，研磨液用巴氏管吸入到 15 ml 離心管中，滴加 200 ~ 500 μl 達優無血清培養基進行低速梯度離心，在 25 ℃ 條件下，800 × g 離心 30 min，吸出淋巴細胞層，加入 10 ml 無血清培養基，顛倒洗滌，室溫、250 × g 離心收集細胞，用于 ELISPOT細胞免疫的檢測。

1.2.3 體液免疫檢測

1.2.3.1 抗菌體抗原總 IgG 抗體水平檢測 用間接 ELISA 法檢測小鼠血清 IgG 的效價。以滅活布氏菌體 5 × 108/ml 的濃度包被 96 孔酶標板，4 ℃ 過夜；以 TBS-T 300 μl 洗板 5 次，用 1% 的BSA 封閉（200 μl/孔），37 ℃ 靜置 1 h；每孔加入100 μl 的 50 × 開始倍比稀釋的待檢血清，37 ℃靜置 1 h；按 1:1000 倍稀釋堿性磷酸酶標記山羊抗小鼠 IgG，洗板后 100 μl/孔加入，37 ℃ 靜置1 h；洗板，加入 100 μl/孔的 pNPP 底物顯色液，室溫避光 30 min 后加入 100 μl/孔終止液（3 mol/LNaOH）終止反應；在波長為 405 nm 處檢測吸光值 A405。

1.2.3.2 抗菌體抗原 IgG 抗體亞類檢測 以滅活布氏菌體 5 × 108/ml 的濃度包被 96 孔酶標板，小鼠免疫 4 周后血清為一抗，堿性磷酸酶標記山羊抗小鼠 IgG1、IgG2a 為二抗，其余操作步驟同1.2.3.1。

1.2.4 細胞免疫檢測

1.2.4.1 分泌 IFN-γ、IL-4 的脾臟淋巴細胞的數目檢測 小鼠免疫 4 周后，分離小鼠脾臟淋巴細胞，取 96 孔細胞培養板，每孔中加混有 2.0 ×106個/ml 濃度細胞 100 μl，每孔分別加入 100 μl布氏 PPD 抗原（終濃度為 5 μg/ml 和 10 μg/ml）和滅活菌體抗原（終濃度為 1 × 108/ml 和 1 ×107/ml）。每種抗原刺激物做復孔，另用細胞培養液作陰性對照，一孔加 ConA 作陽性對照（終濃度為5 μg/ml）。共同孵育 16 h 后，按 ELISPOT 操作依次加入檢測抗體等試劑，洗板，顯色，計數斑點數。

1.2.4.2 體外再刺激免疫小鼠脾細胞因子產生水平檢測 取 48 孔細胞培養板，每孔中加 2.0 ×106個/ml 濃度細胞 400 μl，每孔分別加入 50 μl 布氏 PPD 抗原（終濃度為 5 μg/ml 和 10 μg/ml）和滅活菌體抗原（終濃度為 1 × 108/ml 和 1 ×107/ml）。分別以 ConA（終濃度為 5 μg/ml）和培養基為陽性和陰性對照。37 ℃，5% CO2培養箱中孵育 18 h，孵育完畢對培養物進行離心，取各孔細胞培養液上清，用小鼠 IFN-γ、IL-4 ELISA 試劑盒檢測體外不同刺激物刺激小鼠脾細胞分泌 IFN-γ、IL-4 的情況。

1.2.5 布氏菌活苗保護力檢測 在小鼠免疫 4 周后，各組取 5 只小鼠，對每只小鼠皮下攻擊羊種布氏菌 M5 弱毒株，攻擊劑量為 5 × 108cfu/只，4 周后無菌取脾臟，通過脾臟細菌計數評價布氏活苗的免疫保護作用。

1.3 統計學處理

實驗數據以 x ± s表示，各組動物的效價取以 10 為底的對數后進行 t 檢驗；用 GraphPadPrism 6 繪圖及 SPSS 統計軟件分析，結果以 P <0.05 表示差異有統計學意義。

2、 結果

2.1 小鼠血清中抗菌體抗原總 IgG 水平測定。

小鼠血清用間接 ELISA 方法測抗體水平，結果顯示，陰性組小鼠檢測不到特異性抗體，低劑量組和高劑量組小鼠均可檢測出，但低劑量組抗體水平略高于高劑量組，經統計學分析兩者差異無統計學意義（t = 1.890，P = 0.095 > 0.05，n = 10），結果見圖 1。

2.2 抗菌體抗原抗體亞類測定

抗體亞類分析結果顯示免疫組小鼠均產生特異性 IgG1、IgG2a 抗體，兩者的水平相近，結果見圖 2。

2.3 ELISOPT 結果

將已形成斑點的 96 孔板終止反應，自然風干過夜后上機計數并拍照，對每孔內的斑點進行質控。最終斑點計數顯示低劑量組和高劑量組在不同濃度的 PPD 和滅活菌體抗原刺激下分泌 IFN-γ、IL-4 的脾臟淋巴細胞數明顯多于陰性對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），結果見圖 3、4。

2.4 體外再刺激免疫小鼠脾細胞因子檢測結果

利用 ELISA 方法檢測以 PPD 抗原（5 μg/ml，10 μg/ml）和滅活菌體抗原（1 × 108/ml，1 × 107/ml）體外刺激小鼠脾細胞分泌 IFN-γ、IL-4 水平。結果顯示，在不同濃度 PPD 和滅活菌體抗原刺激下分泌的 IFN-γ 的含量明顯高于陰性組，差異有統計學意義（P < 0.05），結果見圖 5。IL-4 含量很低，達不到標準曲線的檢測限，結果沒有統計學意義。

2.5 布氏菌活苗免疫保護力結果

為評價布氏菌活疫苗的保護力，用羊布氏菌M5 弱毒株皮下攻擊免疫動物，以脾臟布氏菌分離數為指標，評價保護力，結果見圖 6。低劑量免疫組小鼠脾臟的細菌載量與陰性對照組比較有顯著性差異（t = 4.406，P < 0.05，n = 9），高劑量免疫組小鼠脾臟的細菌載量與陰性對照組比較有顯著性差異（t = 3.842，P < 0.05，n = 8）。說明小鼠免疫布氏菌活苗獲得很好的免疫保護。

3、 討論

機體對布氏菌的清除依賴于體液免疫和細胞免疫的聯合作用。體液免疫產生的抗體在細胞外能夠阻斷布氏菌與宿主細胞間相互作用，并將其包裹起來抑制菌體釋放內毒素；在胞內阻止細菌在宿主細胞內的復制繁殖。本試驗以低、高劑量免疫布氏活疫苗，檢測免疫 4 周后血清抗體，結果顯示，低劑量組和高劑量組小鼠可檢測到高滴度特異性抗體，低、高劑量組 IgG 效價幾何均數分別為459、229。由此可見，產生特異性抗體滴度比較低，說明體液免疫水平相對較弱?？贵w亞類分析結果顯示免疫組小鼠均產生特異性 IgG1、IgG2a 抗體，兩者抗體水平相近。

布氏菌是胞內寄生菌，細胞免疫對殺滅布氏菌起關鍵作用。布氏菌感染宿主后被 APC 提呈給吞噬細胞，同時激發 APC 分泌 IL-12、IL-4 細胞因子，引起 Th0 細胞（CD4+）分別分化 Th1 和 Th2細胞。Th1 細胞分泌 IFN-γ 激活吞噬細胞的吞噬功能，參與細胞免疫；Th2 細胞分泌 IL-4 細胞因子主要參與體液免疫。本研究，分別用ELISOPT 和 ELISA 方法對不同濃度的 PPD 和滅活菌體抗原刺激下分泌 IFN-γ 和 IL-4 脾淋巴細胞數目和含量進行檢測。ELISOPT 結果顯示，與陰性組比較，實驗組在不同濃度的兩種刺激物下分泌 IFN-γ、IL-4 脾淋巴細胞數目均有統計學差異；ELISA 結果顯示，與陰性組比較，實驗組在不同濃度的兩種刺激物體外刺激分泌 IFN-γ 含量有顯著差異，IL-4 含量很低。實驗結果充分說明布氏菌疫苗免疫小鼠誘導（CD4+）向 Th1 細胞的分化，機體主要以細胞免疫為主。

疫苗的效力測定實驗是評價疫苗免疫保護性最可靠指標。傳統對布氏疫苗的研究主要是使用豚鼠，效力實驗用強毒株攻擊，本次研究參照《中國藥典》效力測定的方法，以小鼠為動物模型，羊布氏菌 M5 弱毒株攻擊，大大提高了實驗的經濟性和安全性。試驗結果顯示，免疫組小鼠脾臟的細菌載量與陰性對照組比較有顯著性差異，說明小鼠皮下免疫布氏菌活疫苗獲得很好的保護效果。另外，由于小鼠皮上劃痕不易操作，無法加入傳統的劃痕疫苗對照，該比較研究將進一步以豚鼠為模型進行探索。

本次試驗是對皮下免疫效果的初步研究，試驗表明，布氏疫苗采用皮下免疫途徑是可行的，免疫后能獲得很好的免疫原性，注射用布氏活苗有希望代替皮上劃痕用疫苗，不但接種方式簡單，而且接種劑量更低，但能否真正取代傳統劃痕疫苗，還有待強毒布氏菌攻擊保護試驗和臨床試驗進一步研究。