結核病是由結核分枝桿菌\\( Mycobacterium tuberculosis,Mtb\\) 感染引起的以呼吸系統感染為主的慢性感染性疾病。由于結核病導致的組織損傷主要由機體的免疫系統介導,而且在結核病患者體內往往存在 Th1 型免疫應答受抑,Th2 型免疫應答水平異常升高的現象,結核病也被認為是一種免疫紊亂性疾病,機體免疫應答的方向和水平在很大程度上決定著結核病的發展與轉歸。長期以來,人們圍繞結核病免疫相關的 T 淋巴細胞\\( 尤其是 CD4+的 Th1 細胞\\) 、巨噬細胞和樹突狀細胞\\( dendritic cells,DC\\) 進行了大量研究,并取得了一些可喜的進展。目前,為多數研究者肯定的觀點認為,Th1 型免疫應答在結核病的適應性免疫應答中起關鍵作用,是介導結核病保護性免疫的主要群體; 巨噬細胞作為機體抗 Mtb 感染的主要免疫效應細胞,在結核病的保護性免疫應答中也發揮有重要的作用。但是,對于參與結核病免疫的另一個重要的細胞群體,也是 Mtb 感染后最先由外周血遷移至感染病灶的細胞中性粒細胞即多形核中性粒細胞\\( polymorphnuclearneutrophils,PMN\\) 的研究卻明顯滯后。慶幸的是,近年來PMN 在結核病免疫中的作用受到越來越多的關注,相關的研究也取得了較大進展?，F就近年來 PMN 在結核病免疫領域中的相關研究進展進行綜述。
1、 Mtb 感染過程中 PMN 的變化及功能
很早就有研究發現,Mtb 感染后 PMN 會迅速從外周血遷移至 Mtb 感染的局部。研究顯示,無論 Mtb 是經血液還是呼吸道途徑感染人體,PMN 均會很快趨化至感染部位\\( 一般在感染后的 1 ~3 h 內到達感染部位,并在 12 ~ 24 h 時達到峰值\\) 。PMN 到達感染部位后會很快活化并吞噬 Mtb。由于PMN 本身是機體主要的免疫效應細胞之一,研究者推測 PMN可能對于 Mtb 感染的早期控制有重要作用。Yang 等的研究也證實 PMN 能在 Mtb 感染早期迅速吞噬并殺死 Mtb,從而促進 Mtb 的清除。但同時也陸續有研究提示,PMN 可能參與了結核病導致的組織免疫損傷和 Mtb 慢性感染的活化過程。Eum 等在活動性肺結核患者的痰標本、支氣管肺泡灌洗液和肺組織壞死空洞的周圍均檢測到大量的 PMN,而且,Eum 等的研究發現被 PMN 吞噬入的 Mtb 的復制速度較細胞外的 Mtb 還快。在其他疾病模型中的研究也提示,PMN活化后釋放的一些活性酶類會對正常組織造成損傷。
關于 PMN 在 Mtb 感染過程中扮演的具體角色,動物實驗研究同樣充滿爭議。同樣是利用 PMN 的特異性單克隆抗體去除 Mtb 感染動物體內的 PMN,有些研究者發現實驗動物的疾病進展更快、組織病理損傷更為嚴重,提示 PMN 有助于機體控制 Mtb 的感染; 但有的課題組則發現去除 PMN 后實驗動物的組織荷菌量較對照組顯著減少,組織損傷程度明顯下降,動物的存活期顯著延長; 還有的報道認為 PMN 的去除與否對結核病的嚴重程度無明顯影響。
由此可見,PMN 在結核病的發生發展過程中扮演的角色如同一把雙刃劍,它可以通過吞噬和殺傷效應發揮抗 Mtb 感染的功效,但同時,活化后的 PMN 會通過產生的活性產物造成組織器官的直接損傷,促進結核病的進展,也可能通過誘導過度的炎癥性反應導致病理性免疫應答,從而對組織器官造成間接損傷。對于患者最終的臨床表現以及上述研究結果出現的爭議,目前推測可能與 PMN 浸潤的數量、感染機體整體的免疫學狀態、以及感染宿主的遺傳背景有關?？傊?目前對 PMN 在結核病免疫中發揮的功能的認識還很不全面,對其進行系統、動態的研究勢在必行。
2、 PMN 對 Mtb 的吞噬及殺傷作用
目前的研究發現 PMN 主要通過兩種機制介導對 Mtb 的吞噬: 直接識別和調理作用。直接識別機制主要通過模式識別受體介導。其中,Toll 樣受體2\\( Toll-like receptor 2,TLR2\\)和 TLR4 的作用非常關鍵。此外,補體受體 3、補體受體 4 以及甘露糖結合凝集素等也在 PMN 識別 Mtb 的過程中發揮重要作用。除了直接識別,PMN 還能通過調理作用識別和吞噬 Mtb,研究提示這種作用與抗分枝桿菌抗體相關,如 de Valliere 等的研究發現,注射 BCG 疫苗的志愿者體內的 PMN 吞噬 BCG 的能力明顯增強。但目前,對參與 Mtb 調理作用的具體抗體并不是很清楚。
研究發現,PMN 吞噬 Mtb 后會迅速活化,產生大量活性氧\\( reactive oxygen species,ROS\\) 和抗菌肽等殺菌物質,并通過脫顆粒作用釋放大量顆粒酶,但對于 PMN 對 Mtb 的殺菌能力目前仍存大很大爭議。如 Yang 等的研究提示 PMN 能通過 NADPH 氧化酶介導產生大量 ROS,對被吞噬的 Mtb 進行有效地殺傷,姜麗娜等研究發現 IL-12 能增強 PMN 吞噬和殺傷 Mtb 的活性,但 Corleis 等的研究則發現活化 PMN 產生的 ROS 不僅不能殺傷 Mtb,還會導致 PMN 的壞死,從而促進 Mtb 的免疫逃逸。Corleis 等的研究同時發現,這種逃逸機制與 Mtb 攜帶的差異區 1\\( region of difference 1,RD1\\) 基因產物相關,若敲除 RD1 基因,Mtb 則不能誘導 PMN 壞死且能被 PMN 殺傷。此外,還有的研究提示 PMN 可能被 Mtb“脅迫”,成為 Mtb 向遠處組織播散的“特洛伊木馬”。
通過對上述研究進行分析可以發現,造成這些矛盾結果的原因可能與 PMN 免疫效應作用的多樣性、感染宿主及 Mtb菌株的遺傳背景等有關。如 Yang 等的研究主要從 PMN 與巨噬細胞的相互作用方面,探討 PMN 在斑馬魚結核性肉芽腫形成早期的免疫保護作用。而 Corleis 等的研究則以純化的人外周血 PMN 為研究對象,探討離體的人源性 PMN 對不同毒力 Mtb 的殺傷作用。因此這些研究雖然都以 PMN 為研究主體,但研究所采用的 PMN 的來源、遺傳背景、所處環境等均有差異,效應檢測時間及采用的感染菌株也不相同。對PMN 在結核病發生、發展過程中的作用進行系統和動態的研究將有助于客觀、全面地了解 PMN 在結核病免疫中的功能。
3、 Mtb 感染過程中 PMN 的免疫調節作用
長期以來,人們認為 PMN 僅僅作為一種吞噬細胞,在Mtb 感染的早期參與抗結核病的固有免疫應答,因此較早期的研究大都局限在 PMN 對 Mtb 的吞噬和殺傷能力的探討方面,在很大程度上限制了人們對 PMN 在抗結核病免疫中的認識。然而目前越來越多的證據顯示,PMN 在抗結核病免疫中的作用遠非先前認為的那樣簡單,其不僅參與了 Mtb 感染早期的固有免疫應答,也參與了結核病適應性免疫的誘導和調節,對結核病免疫的發展有重要影響。已有的研究顯示,PMN 在 Mtb 感染過程中發揮免疫調節的途徑和機制至少包括以下幾個方面。
3. 1 分泌細胞因子 研究發現,感染 Mtb 后 PMN 可分泌一系列細胞因子,如 IL-8、IL-10、IL-12、腫瘤壞死因子-α\\( tumornecrosis factor,TNF-α\\) 、巨噬細胞炎性蛋白 1、單核細胞趨化蛋白 1 等。通過這些細胞因子,PMN 至少可通過以下 2 種機制參與結核病免疫的調節: 誘導或趨化更多的其他免疫細胞至感染部位。如 PMN 產生的 IL-8、巨噬細胞炎性蛋白 1 和單核細胞趨化蛋白 1 等是多種炎性細胞的趨化因子,可吸引更多炎性細胞到感染灶部位。調節其他免疫細胞的分化方向和活化水平。如 IL-12 是經典的 Th1 型細胞因子,可誘導初始T 淋巴細胞向 Th1 方向分化; TNF-α 是介導結核病保護性免疫的關鍵細胞因子之一,可促進巨噬細胞和 T 細胞等的活化,在機體清除和控制 Mtb 感染的應答過程有重要的調節作用。
Swant 等通過建立 PMN 和巨噬細胞的共培養體系發現,感染了 Mtb 的 PMN 可分泌大量 TNF-α,當采用特異性單克隆抗體中和 PMN 分泌的 TNF-α 后,巨噬細胞的活化水平明顯下降,直接證實了 PMN 產生的 TNF-α 可促進巨噬細胞的活化。此外,有研究證實,Mtb 感染后病灶局部微環境中的 IL-10 主要來源于 PMN。一方面,這些 IL-10 可能在限制機體的免疫病理反應方面發揮作用,但另一方面又可能抑制巨噬細胞對 Mtb 的反應性,并限制機體的獲得性免疫應答。
3. 2 通過釋放細胞內容物參與對其他免疫細胞的調控PMN 發生活化后可通過脫顆粒作用釋放大量的細胞內容物,如彈性蛋白酶、乳鐵蛋白、堿性磷酸酶、抗菌肽、人中性粒細胞多肽\\( human neutrophil peptides,HNP\\) 等。近年的研究發現,這些釋放至胞外的生物活性物質除直接參與殺菌作用外,還可能作用于周圍的免疫細胞,參與抗結核病免疫的調節。
如 Tan 等的研究發現,發生凋亡的 PMN 可被鄰近的巨噬細胞吞噬,并將其攜帶的 HNP 等殺菌物質釋放至巨噬細胞中,顯著增強巨噬細胞殺滅 Mtb 的能力。其后,利用 PMN 釋放的亞組分進行的研究進一步肯定了這種作用。如體外研究證實,PMN 釋放的游離 HNP 可被巨噬細胞和 DC 吞噬,而吞噬 HNP 后,巨噬細胞對 Mtb 的殺菌能力明顯增強,DC 提呈Mtb 抗原、激活抗原特異性 T 細胞的功能也獲得很大提高。
隨后,研究證實 PMN 釋放的乳鐵蛋白同樣能增強抗原提呈細胞對分枝桿菌抗原的提呈功能,促進特異性 T 細胞的活化和增殖。同樣,PMN 釋放的顆粒酶也能被巨噬細胞攝取,增強巨噬細胞殺傷和清除 Mtb 的能力。如 Jena 等研究發現,PMN 的嗜苯胺藍顆粒被巨噬細胞吞噬后能增強巨噬細胞內Mtb 吞噬體與溶酶體的融合水平,大大增強巨噬細胞對 Mtb的殺傷能力。因此,通過釋放的顆粒酶和 HNP 等生物活性物質調節其他免疫細胞的功能也是 PMN 參與結核病免疫的重要機制之一。
3. 3 通過直接接觸調控其他免疫細胞的功能 人體試驗及動物模型中的研究均已證實,CD4+T 細胞介導的 Th1 型免疫應答在結核病的保護性免疫中起主要作用,是機體清除或控制 Mtb 的主要獲得性免疫機制。但對活動性結核病患者的研究同時發現,T 細胞免疫應答可能也參與了結核病的組織免疫損傷。因此,適度的 T 細胞免疫應答對控制 Mtb 的感染至關重要,但對于如何維持這種精確的免疫平衡目前我們仍然不是很清楚。
根據目前公認的免疫雙信號學說,T 細胞的活化需要2 個信號系統共同參與。第一信號由抗原提呈細胞 \\( antigenpresenting cell,APC\\) 表面的 MHC / Ag 復合物與 T 細胞抗原識別受體\\( T cell receptor,TCR\\) /CD3 結合后提供,第二信號則由 APC 上的共刺激分子與 T 細胞上相應的受體結合后介導。研究證明,T 細胞接觸 MHC/Ag 復合物后可能產生 2 種截然不同的后果: 增殖、分化為不同的效應細胞; 無反應性或凋亡。這 2 種結果的出現以及 T 細胞分化的方向主要決定于APC 所傳遞的共刺激信號。因此,APC 表面共刺激分子的類型和表達水平對 T 細胞免疫應答的性質及強度至關重要。
而近年的研究發現,在 PMN 中同樣表達有 APC 相關的表面分子和共刺激分子。如 Abi Abdallah 等的研究發現,在體外與 T 細胞進行混合培養后,小鼠 PMN 可同時高表達MHC Ⅱ類分子和共刺激分子如 CD80 和 CD86,具備專職 APC的雙信號系統表型。以 OVA 激發小鼠 PMN 后,PMN 可高效處理 OVA 抗原并通過 MCH Ⅱ類分子依賴的方式將 OVA 肽抗原提呈給 OVA 特異性的 T 細胞,啟動抗原特異性 Th1 和Th17 細胞的免疫應答,證實 PMN 可發揮專職 APC 的類似功能。McNab 等發現,活動性肺結核病人的 PMN 表面程序性死亡配體 1\\( programmed death ligand-1,PD-L1\\) 表達顯著升高,由于 PD-L1 與 T 細胞表面程序性死亡分子 1\\( programmeddeath-1,PD-1\\) 結合后,產生共抑制信號,抑制 T 細胞增殖分化和細胞因子的分泌。因此,推測 PD-L1 升高可能是結核病的一種致病因素。除了通過共刺激分子調控 T 細胞的分化和活性外,研究發現 PMN 還能通過其他直接接觸的方式參與其他免疫細胞的功能調控。如 Hedlund 等的研究發現,與直接用 Mtb 感染 DC 相比,采用感染 Mtb 的 PMN 與 DC 混合培養能更有效地促進 DC 成熟,極大提高 DC 提呈 Mtb 抗原的能力。該研究同時發現,這種促進 DC 細胞成熟的作用依賴于感染 Mtb 的 PMN 與 DC 細胞的直接接觸,其中 DC 特異性細胞間黏附分子-3-結合非整合素分子 \\( dendritic cell-specificintercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintergrin,DC-SIGN\\) 和細胞黏附分子-巨噬細胞分化抗原 \\( macrophagedifferentiation antigen-1,Mac-1\\) 在這一過程中起著關鍵作用,說明 PMN 能通過凝集素-整合素途徑參與對 DC 的功能調節,進而影響機體抗 Mtb 感染的獲得性免疫應答。
4、 結語和展望
PMN 是人體抵抗病原微生物入侵的主要免疫效應細胞之一。Mtb 感染機體后,外周血中的 PMN 可在1 ~3 h 內遷移至Mtb 感染的局部,迅速吞噬 Mtb 并發生自身活化。目前對PMN 在 Mtb 感染過程中所發揮的作用的研究和認識仍存在很大爭議,但越來越多的研究證實 PMN 在結核病免疫中扮演了重要的角色。雖然 PMN 在 Mtb 感染過程中表現出功能復雜且充滿不確定性,不過已有研究提示 PMN 的功能具有很大可塑性,這為以 PMN 為靶標進行結核病的治療、延緩或逆轉結核病過程中的組織免疫損傷提供了可能。當然,目前的研究說明我們對 PMN 在結核病免疫中發揮的作用的認識還很不全面,已有的研究大多停留在對現象的觀察上,對其中的分子機制還未進行深入地探討,因此有必要對 Mtb 感染過程中PMN 的變化、功能和相關機制進行深入和系統的研究。
