皮膚損傷創面治療是臨床常見問題,如患者伴有免疫功能低下及糖尿病等疾病,傷口通常較難愈合,如何促進創面愈合并提高愈合質量一直是研究的熱點。創傷修復是由多種細胞、細胞因子參與、且相互作用的復雜過程,膠原蛋白作為細胞外基質重要組成成分可促進多種細胞如成纖維細胞、內皮細胞的遷移、分化和增殖,并可促進生長因子等細胞因子的產生,促進傷口愈合。Chai 等發現,將熒光標記的魚鱗膠原蛋白置于小鼠皮膚表面,魚鱗膠原蛋白可透過皮膚角質層,并可活化成纖維細胞,增強皮膚的彈性及保濕性。Castillo-Brice\ue570o 等研究發現: 膠原蛋白中的 GFOGER、GLOGEN 結構域可促進成纖維細胞的黏附、增殖及 IL-1β 基因的表達。利用膠原蛋白膠制成的敷料治療糖尿病小鼠皮膚潰瘍,治療第 7 天,可使傷口縮小 62%。目前,天然膠原蛋白主要來源于畜類及禽類動物組織,但由于瘋牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的爆發,使陸生哺乳動物膠原蛋白的安全性普遍受到質疑。我國水產品豐富,在加工魚產品同時產生大量下腳料,其中魚鱗約占總質量 5%,通常被當作垃圾丟棄,我國每年丟棄的魚鱗約有 30 萬噸。蛋白質是魚鱗的主要成分,約占總重的 70%,其中主要是膠原蛋白和魚鱗硬蛋白。本室的前期工作表明,水提法提取的魚鱗膠原蛋白可清除氧自由基,提高超氧化物歧化酶\\( superoxide dismutase,SOD\\) 、過氧化氫酶\\( catalase,CAT\\) 含量,具有良好的生物學活性。在此基礎上,本研究利用水提法提取魚鱗膠原蛋白,觀察膠原蛋白對成纖維增殖及對免疫功能低下小鼠傷口愈合的影響,為魚鱗膠原蛋白開發利用及損傷修復治療研究奠定基礎。

1、 材料與方法

1. 1 材料

魚鱗取自牡丹江市新瑪特超市\\( 新鮮的各種魚鱗混合物\\) 。BALB/C 小鼠,雌雄各半,體重 18 ~20 g; 3 日齡內 Wsitar 乳鼠,由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供。RPMI 1640 培養基為Gibco公司產品,ELISA 試劑盒為 RD 公司產品,引物由上海生工生物工程有限公司合成,SYBR PremixEx TaqTM為 TaKaRa 公司產品。

1. 2 方法

1. 2. 1 魚鱗膠原蛋白膜制備: ①魚鱗前處理: 新鮮魚鱗清水沖洗→烘干→1%鹽酸溶液脫鈣→清水、蒸餾水沖洗→調 pH 值→烘干,備用。②水提法制備魚鱗膠原蛋白膜: 取適量經處理魚鱗,搗碎,按 1∶ 30比例加入蒸餾水,100 ℃ 水浴 30 min,80 ℃ 水浴1. 5 h,4 ℃ 、8 000 r / min 離心 20 min,取上清,經0. 45 μm 濾膜過濾除菌后,于超凈臺內自然干燥后即得魚鱗膠原蛋白膜。③膠原蛋白含量測定: 采用對二甲基氨基苯甲醛比色法測定膠原蛋白特征氨基酸-羥脯氨酸的含量,測得值 × 11. 1 即為膠原蛋白的量。提取率 = 提取的膠原蛋白量/魚鱗中總的膠原蛋白量 ×100%。

1. 2. 2 魚鱗膠原蛋白對大鼠真皮成纖維細胞增殖的影響: 大鼠真皮成纖維細胞分離: 取 3 日齡內的Wsitar 乳鼠背部皮膚,加入 0. 25% 中性蛋白酶溶液,4 ℃ 酶解消化過夜,分離真皮、表皮。將真皮部分加入0. 25%的Ⅰ型膠原酶37 ℃酶解消化1 h。PBS 溶液洗滌離心、200 目細胞篩過濾去除基質成分,得到的細胞為大鼠真皮成纖維細胞。MTT 法檢測魚鱗膠原蛋白對大鼠真皮成纖維細胞增殖的影響:取適量無菌膠原蛋白膜,用 1640 培養液溶解制成濃度為 5、10、20、40 mg/L 液體,與生長狀態良好的大鼠真皮成纖維細胞 4 × 103個共同培養于 96 孔板中,未加膠原蛋白孔為空白對照。培養 48 h 后,每孔加入 MTT 溶液\\( 5 g/L\\) 20 μL,繼續培養 4 h。棄上清,每孔加入 DMSO 溶液 150 μL,振蕩 10 min,于490 nm 處檢測吸光度\\( OD\\) 值。增殖率 E\\( % \\) 按以下公式計算。E\\( %\\) = \\( A樣品- A0\\) /A0× 100% \\( A0為空白對照組吸光度值; A樣品為膠原蛋白組吸光度值\\) 。

1. 2. 3 免疫低下小鼠皮膚損傷模型制備: 利用環磷酰胺誘導小鼠免疫低下。將小鼠腹腔注射環磷酰胺50 mg / kg,每天 1 次,連續 2 天,建立小鼠免疫低下模型。隨機取正常小鼠 10 只,作為正常組; 取免疫低下小鼠40 只,隨機分為4 組\\( 模型組、魚鱗膠原蛋白 1 mg、0. 5 mg、0. 25 mg 組\\) 。乙醚麻醉,背部去毛,消毒,用特制打孔器在小鼠背部打一直徑為1 cm 的圓形孔,切除皮膚全層。造模第 1 天,正常組、模型組傷口處覆蓋無菌紗布,魚鱗膠原蛋白組傷口處覆蓋含量為 1 mg、0. 5 mg、0. 25 mg 的魚鱗膠原蛋白膜,每日更換紗布及給藥 1 次,觀察傷口愈合情況,并將創面描記在半透明紙上,計算創面面積大小,按以下公式計算創面愈合率,創面愈合率\\( %\\)= \\( 開始創傷面積 - 未愈合創面面積\\) / 開始創傷面積。

1. 2. 3. 1 檢測 PDGF、TGFβ mRNA 表達: 皮膚損傷后第 5、7、10 天切取模型組、魚鱗膠原蛋白 1 mg 組、正常組傷口組織,勻漿器研磨,利用 Trizol 試劑法提取 RNA。取 1 μg RNA 利用 M-MLV 逆轉錄酶法合成 cDNA。PCR 采用 SYBR Green 染料法,PDGF 上游引物為 5'-CCTGCCCATTCGGAGGAAGAG-3',下游引物為 5'-TTGGCCACCTTGACGCTGCCG-3'。TGFβ上游引物為 5'-GCTAATGTTGTTGCCCTCCTAC-3',下游引物為 5'-GGACTTTGGTGTGTTGAGTGTC-3'。

PCR 反應條件為: 50 ℃ ,2 min,94 ℃ ,10 min,1 循環; 94 ℃,15 s,60 ℃,1 min,40 循環。以 GADPH 為內參基因,用 2- ΔΔCt法處理數據。

1. 2. 3. 2 檢測 PDGF、TGFβ 含量: 皮膚損傷后第 5、7、10 天切取模型組、魚鱗膠原蛋白 1 mg 組、正常組傷口組織,加適量生理鹽水將組織搗碎,4 ℃、7 500 r / min離心 15 min,取上清,按說明書 ELISA檢測 PDGF、TGFβ 含量。

1. 2. 3. 3 流式細胞術檢測傷口處 M2 型巨噬細胞含量: 皮膚損傷后第 10 天切取模型組、魚鱗膠原蛋白 1 mg 組、正常組傷口組織,用適量生理鹽水沖洗后,放入含有 0. 1% 膠原酶,300 U/mL DNAase 的PBS 中 37 ℃ 消化 90 min,離心取上清,用 40% /70%不同密度的淋巴細胞分層液梯度離心,即可得到巨噬細胞。將巨噬細胞與 FITC 標記的抗小鼠 F4/80、PE 標記的抗小鼠 CD206 抗體4 ℃ 共同孵育 30 min,PBS 洗滌后,上機檢測。

1. 3 統計學處理。

應用 SPSS 17. 0 軟件,通過 t 檢驗進行統計學分析,數據以珋x ± s 表示,P < 0. 05 為差異有顯著性意義,P <0. 01 為差異具有非常顯著性意義。

2、 結果

2. 1 魚鱗膠原蛋白對大鼠真皮成纖維細胞增殖的影響

實驗結果顯示,魚鱗膠原蛋白無細胞毒性、具有良好的促進成纖維細胞增殖作用,并呈一定劑量依賴關系,當魚鱗膠原蛋白濃度達到40 mg/L 時,增殖率可達 38. 65%\\( 圖 1\\) 。

2. 2 魚鱗膠原蛋白對傷口愈合率的影響

與正常組相比,免疫低下小鼠傷口愈合明顯遲緩,造模第 5 天,正常組的愈合率達到 25. 15%。而免疫低下小鼠的愈合率僅為 8. 34%。魚鱗膠原蛋白具有良好的組織相容性,無細胞毒性作用,將魚鱗膠原蛋白膜覆蓋在傷口上,明顯促進了免疫低下小鼠傷口愈合。與模型組相比,造模第 5 天,魚鱗膠原蛋白 1 mg 組即明顯促進了傷口愈合,愈合率已達18. 19% \\( P < 0. 01\\) 。第 10 天,0. 5 mg 魚鱗膠原蛋白組可明顯促進傷口愈合\\( P < 0. 05\\) ,愈合率達57. 37% ,1 mg 魚鱗膠原蛋白組愈合率已接近正常組。第 15 天,1 mg 組愈合率已達到 96. 34%。魚鱗膠原蛋白 0. 25 mg 組促愈合作用無顯著性差異\\( 圖2\\) 。

2. 3 魚鱗膠原蛋白對傷口處 PDGF mRNA 表達及合成的影響

實驗結果顯示,與模型組相比,造模第 5 天,魚鱗膠原蛋白 1 mg 治療劑量即可促進傷口處 PDGFmRNA 表達。造模第 10 天,PDGF mRNA 表達水平接近正常組\\( 膠原蛋白組 PDGF mRNA 表達量是模型組的 2. 31 倍,正常組的表達量是模型組的 2. 38倍,圖 3\\) 。ELISA 檢測結果\\( 圖 4\\) 進一步表明魚鱗膠原蛋白可促進 PDGF 蛋白合成。

2. 4 魚鱗膠原蛋白對傷口處 TGFβ mRNA 表達及合成的影響

實驗結果顯示,與模型組相比,魚鱗膠原蛋白1 mg治療劑量可促進傷口處 TGFβ mRNA 表達,造模第 10 天,TGFβ mRNA 表達水平接近正常組\\( 膠原蛋白組 TGFβ mRNA 表達量是模型組的 2. 29 倍,正常組的表達量是模型組的 2. 38 倍,圖 5\\) 。ELISA檢測結果\\( 圖 6\\) 進一步表明,魚鱗膠原蛋白可通過促進 TGFβ 表達及合成,促進免疫低下小鼠傷口愈合。

2. 5 魚鱗膠原蛋白對傷口處 M2 型巨噬細胞含量的影響

實驗結果顯示,與模型組相比,魚鱗膠原蛋白1 mg治療劑量可促進巨噬細胞向傷口處聚集及向M2 巨噬細胞轉化。造模第 10 天,魚鱗膠原蛋白組傷口處巨噬細胞中M2型巨噬細胞含量可達38. 57% ,而模型組的含量僅為 25. 26% \\( 圖 7\\) 。

3、 討論

膠原蛋白是細胞外基質重要組成成分,在損傷修復過程中發揮重要作用。目前,天然膠原蛋白提取的主要方法為酸法及酶法,但該提取方法時間長,成本高,且大量腐蝕性物質對生產設備要求較高,不適合大規模生產。本室前期工作表明: 與酸法相比,水提法同樣可以有效的提取魚鱗膠原蛋白,且提取的膠原蛋白具有良好的清除氧自由基,提高SOD、CAT 含量作用。本研究采用水提法提取魚鱗膠原蛋白,觀察對免疫低下小鼠傷口愈合作用。

成纖維細胞是構成肉芽組織的主要成分之一,能合成、分泌大量膠原蛋白、纖維連接蛋白等細胞外基質,為表皮細胞的覆蓋創造條件,還可分 泌PDGF、TGFβ、FGF 等多種細胞因子,通過多途徑參與修復過程。本研究利用原代培養的大鼠真皮成纖維細胞,觀察魚鱗膠原蛋白對成纖維細胞增殖的影響。結果表明: 水提法提取的魚鱗膠原蛋白具有良好的生物相容性,可以劑量依賴的方式促進成纖維細胞增殖,當濃度達到 40 mg/L 時,增殖率可達38. 65% 。

組織損傷修復是由多種細胞、因子參與的復雜過程。PDGF、TGFβ、FGF 等因子可通過多途徑調控修復過程,促進傷口愈合。PDGF 是第一個批準臨床用于治療皮膚損傷的細胞因子,Nagai 等、Man-dracchia 等用 Becaplermin\\( 重組人 PDGF\\) 治療糖尿病患者的皮膚潰瘍,發現 Becaplermin 可促進細胞的遷移、增殖,促進細胞因子的產生,促進傷口愈合。

在證實魚鱗膠原蛋白可促進成纖維細胞增殖、促進小鼠皮膚傷口愈合基礎上,觀察膠原蛋白對 PDGF、TGFβ mRNA 表達及蛋白合成的影響。 Real timePCR 檢測結果表明: 膠原蛋白 1 mg 治療劑量在治療早期,第 5 天即可促進 PDGF、TGFβ mRNA 表達,表達量分別為模型組的 1. 52 倍、1. 34 倍。治療第 10天,表達量已接近正常組。ELISA 檢測結果進一步證實: 膠原蛋白可促進傷口處 PDGF、TGFβ 蛋白合成。因此,魚鱗膠原蛋白可通過促進傷口處 PDGF、TGFβ mRNA 表達及蛋白合成,促進傷口愈合。巨噬細胞在組織損傷修復中發揮重要作用。巨噬細胞功能具有可塑性及多樣性,隨微環境變化發生極化從而表現出不同的巨噬細胞亞型。M2 型巨噬細胞可大量分泌 IL-10、TGFβ、PDGF 等因子,抑制炎癥反應,參與組織損傷修復等過程。為進一步證實魚鱗膠原蛋白促進免疫低下小鼠傷口愈合的作用,利用流式檢測了傷口處 M2 型巨噬細胞含量,結果表明: 魚鱗膠原蛋白可明顯促進巨噬細胞向傷口處聚集及向 M2 型轉化,可通過提高巨噬細胞活性,促進傷口愈合。

本研究結果表明,水提法提取的魚鱗膠原蛋白具有良好的生物相容性,可通過促進成纖維細胞增殖,促進 PDGF、TGFβ mRNA 表達及蛋白合成,提高M2 型巨噬細胞含量,促進免疫低下小鼠傷口愈合,其臨床應用價值值得進一步深入研究。