金屬硫蛋白（ metallothionein,MT） 于 1957 年由哈佛大學的 Margoshes 和 Vallee 在研究馬腎臟蓄積鎘的過程中首次發現并分離，是一類低分子質量（ Mr） 、富含半胱氨酸、不含芳香族氨基酸和組氨酸、能被多種金屬誘導并結合多個金屬原子的非酶類蛋白質.
MT 普遍存在于生物界中，在生物體內其所有的半胱氨酸均處于還原狀態，具有清除體內自由基、解除重金屬毒性、增強機體對各種不良適應能力等功能.
特別是作為一種重要的重金屬解毒蛋白，體內唯一能有效解離、解毒重金屬的一種生物途徑，MT 成為重金屬污染監測和治理的研究熱點.重金屬進入機體可特異性誘導 MT 的高水平表達，進而螯合一定的重金屬形成重金屬-MT 復合物，或者奪取與其他功能蛋白結合的重金屬離子來降低功能蛋白的損傷，減少重金屬對組織的損害.由于水生生物體內的MT與水環境和體內組織中重金屬之間顯著的相關性，因而生物組織中的 MT 含量可以作為水環境監測重金屬暴露的一個分子生態毒理學指標，為確定水環境污染程度提供客觀和全面的指標.現階段 MT含量的測定方法主要有金屬結合法、電化學法、色譜分析法等，因 MT 蛋白的特殊性，上述測定方法無一不受 MT 結合金屬種類、MT 同形體多態性等因素的影響而對結果產生偏差.受制于 MT 定量測定方法的限制，MT 在環境監測中的應用尚未進一步開發。目前許多學者通過制備特異性抗體建立免疫學檢測方法定量檢測 MT,相關報道主要集中在魚類和貽貝、牡蠣等海洋動物中，且主要通過制備多克隆抗體來實現.而與淡水蟹類的相關研究，特別是 MT單克隆抗體（ monoclonal antibodies,mAb） 制備尚未見報道。
河南華溪蟹（ Sinopotamon henanense） ,由海洋蟹多元轉化而成，終身棲息于淡水中，屬于甲殼綱、十足目中一個特殊分支。作為生活于水體基底層的低等生物，溪蟹直接面對沉積在水體的金屬離子，是一種理想的水環境監測指示生物.本研究在原核表達純化重組河南華溪蟹 MT 的基礎上，制備其 mAb,為深入研究 MT 的生物學功能以及建立快速、敏感的新型免疫學檢測方法奠定基礎。
1 材料和方法
1. 1 材 料
重組工程菌 PET-28a-SUMO-MT /BL21 （ DE3 ） 、phoA-MT / BL21（ DE3 ） 由本實驗室構建、保存。 健康雌性BALB / c 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；Quick Antibody-Mouse5W 免疫佐劑購自北京康碧泉生物技術公司； PEG1500 購自 Roche 公司； HT、HAT、ITS 合劑、青-鏈霉素、胰島素、L-谷氨酰胺、抗體亞類鑒定試劑盒均購自Sigma公司； NCTC-109 培養基購自 Gibco 公司； DMEM / F12 培養基、胎牛血清購自 HyClone 公司； β-巰基乙醇購自北京索萊寶科技有限公司； PVDF 膜、NC 膜購自 Bio-Rad 公司； HRP 標記的山羊抗小鼠 IgG 購自 GeneTex 公司； 堿性磷酸酶（ alkalinephosphatase,AP） 標記的山羊抗小鼠 IgG 購自生工生物工程（ 上海） 股份有限公司； 鄰苯二胺（ o-phenylenediamine,OPD）和 NBT/BCIP 顯色劑購自 Amresco 公司； 其余常規試劑均為國產分析純。HGPRT 缺陷型小鼠骨髓瘤細胞株 Sp2/0 購自中國典型培養物保藏中心，融合前經 8-氮鳥嘌呤篩選 2 周。
1. 2 方法
1. 2. 1 抗原的制備 免疫用抗原小泛素樣修飾蛋白-金屬硫蛋白（ small ubiquitin-like modifier-metallothionein,SUMO-MT）的制備： 重 組 工 程 菌 PET-28a-SUMO-MT/ BL21 （ DE3） 經1 mmol / L IPTG 誘導表達可溶性重組融合蛋白 SUMO-MT,利用 Ni 離子螯合柱分離純化后超濾濃縮交換至 pH7. 8、0. 01 mol / L Tris-HCl 儲存液，操作步驟依據文獻方法進行.檢測用抗原 His-MT 的制備： MT 基因片段與質粒 phoA 通過NcoⅠ和 BamHⅠ雙酶切位點進行連接，轉化大腸桿菌 BL21（ DE3） 構建重組工程菌 phoA-MT/BL21（ DE3） ,經低磷酸鹽誘導后分泌表達可溶性重組蛋白 His-MT,同樣經 Ni 離子螯合柱分離純化，超濾濃縮交換至儲存液保存。
1. 2. 2 動物免疫 選擇 6 周齡雌性 BALB / c 小鼠，取純化后的重組 SUMO-MT 蛋白免疫小鼠。初次免疫用免疫抗原SUMO-MT與等體積 Quick Antibody-Mouse5W 水溶性免疫佐劑迅速混合后，于小鼠后腿小腿肌肉注射免疫，每只小鼠注射100 μL,免疫劑量為 25 μg.免疫前尾部靜脈取血作為陰性對照。3 周后按照同樣的方式加強免疫 1 針。5 周后，采微量尾血進行間接 ELISA 檢測。當血清滴度達到要求后，融合前3 d 加倍劑量與等體積生理鹽水混勻，腹腔注射沖擊免疫。融合前，小鼠摘除眼球取血，并分離血清作為陽性對照。
1. 2. 3 細胞融合 將免疫小鼠脾細胞懸液和生長狀態良好的 Sp2/0 細胞以 10∶1 的比例在 PEG1500 作用下進行融合，融合前 PEG1500 于 50 mL/L CO2培養箱中孵育 24 h.加入含HT 篩選培養基 （ 含 50 mL / L DMEM / F12 培養基、10 mL / LNCTC-109 培養基、20 mL / L 胎牛血清和 1 mL / L ITS 合劑） ,接種 于 96 孔 培 養 板 中，1 × 106/ mL,100 μL / 孔。37℃ 、80 mL / L CO2培養 1 d 后，換成含 HAT 篩選培養基培養。7 ~ 14 d后改用含 HT 篩選培養基培養，14 d 后換用普通培養基培養。
1. 2. 4 雜交瘤細胞篩選與克隆 根據 Kim 等建立的間接ELISA 篩選分泌抗 MT mAb 的雜交瘤細胞株。選取 96 孔酶標板，每孔用碳酸鹽緩沖液（ 0.5 mol/L Na2CO3/ NaHCO3,pH9.6） 包被重組 His-MT（ 10 μg/mL,100 μL/孔） ,以 1∶1 000 的免疫小鼠血清為陽性對照，1∶1 000 的未免疫正常 BALB/c 小鼠為陰性對照，1∶5 000 稀釋的山羊抗小鼠 IgG-HRP 為二抗； 以鄰苯二胺（ OPD） 溶液為反應底物，492 nm 處酶標儀測定各孔 A 值，以 P/N≥2. 1 時判定為陽性。同時用含 His-tag 的重組 IGF 蛋白包被做交叉篩選。采用有限稀釋法對連續 3 次檢測為陽性的細胞株進行亞克隆，即調整細胞數 至 每 毫 升 10 個，100 μL / 孔鋪 96 孔細胞培養板，亞克隆培養 10 d 后檢測上清。重復進行 3 次亞克隆，至 100% 雜交瘤細胞上清液均呈陽性時為建株標準。
1. 2. 5 抗 MT mAb 亞類鑒定 處于對數生長期、生長旺盛的雜交瘤細胞，更換培養于未添加胎牛血清的 DMEM/F12 培養基，繼續培養 2 ~3 d 后收集細胞培養上清，按照抗體亞類鑒定試劑盒操作說明進行亞類鑒定。
1. 2. 6 mAb 腹水制備及純化 以液體石蠟作為致敏劑，選取 22 周齡經產 BALB/c 小鼠，以 0. 5 mL/只注射液體石蠟。
將篩選獲得的雜交瘤細胞株擴大培養后，以 1 × 105/ mL ~1 × 107/ mL 的細胞數接種雜交瘤細胞株至小鼠腹腔內生產腹水。10 ~12 d 后收集腹水，3 000 r/min 離心 15 min,收獲上清。間接 ELISA 測定腹水效價。收獲的腹水上清，采用疏水性電荷誘導層析 （ hydrophobic charge induction chromatography,HCIC） 和蛋白 A 親和層析相結合的方法純化腹水，操作步驟依據文獻[11]方法進行。純化的樣品經 120 g/L SDS-PAGE分析其純度。
1. 2. 7 Western blot 法和 Dot-ELISA 鑒定 重組 SUMO-MT 和重組 His-MT 行 150 g/L SDS-PAGE 后，電轉印至 PVDF 膜上；用含 50 g/L 脫脂奶粉的 PBST 封閉過夜，PBST 洗膜 4 次，10 min / 次，加入 1 ∶ 2 000 稀釋的 mAb 作為一抗，4℃ 過夜；PBST 洗膜 4 次后，加入 1∶5 000 稀釋的 AP 標記的山羊抗小鼠IgG,室溫反應 2 h; 用 PBST 洗膜 4 次后，最后用 BCIP / NBT顯色試劑盒避光顯色并拍照。按照本實驗建立的方法制備河南華溪蟹肝胰腺組織 MT 粗提液.分別取經 IPTG 和低磷酸鹽誘導的 PET-28a-SUMO-MT/BL21（ DE3） 、phoA-MT/BL21（ DE3） 裂解液上清、重組 SUMO-MT、重組 His-MT、重組His-IGF及河南華溪蟹肝胰腺組織 MT 粗提液各 5 ~ 10 μL 點1封閉液振蕩封閉 30 min.PBST 洗滌后，加入所獲的 mAb,37℃ 振蕩孵育 30 min; PBST 充分洗滌后，加入 HRP 標記的山羊抗小鼠 IgG（ 1∶5 000 稀釋） ,37℃振蕩孵育 30 min; 充分洗滌、濾紙吸干后，DAB 顯色分析。
1. 2. 8 mAb 抗原識別位點分析 按照文獻方法,利用ELISA 疊加試驗對 2 株 mAb 的抗原識別位點進行分析檢測。利用間接 ELISA 測定 mAb-MT2 和 mAb-MT3 2 株 mAb 飽和值。按照上述建立的 ELISA,一抗分別為飽和濃度 mAb-MT2、飽和濃度 mAb-MT3、飽和濃度 mAb-MT2 聯合飽和濃度 mAb-MT3、飽和濃度mAb-MT3 聯合飽和濃度 mAb-MT2,測定 A492nm值，計算增殖指數（ AI） .按如下公式計算： AI = （ A1 + 2- A1） /A2×100% .式 中： A1為 mAb-MT2 A492值； A2為 mAb-MT3 的A492值； A1 + 2為 mAb-MT2 疊加 mAb-MT3 的 A492值。AI <10%為針對同一抗原位點，AI≥10%為針對不同抗原位點。
2 結果
2. 1 SUMO-MT 和 His-MT 重組蛋白的表達和純化重 組 工 程 菌 PET-28a-SUMO-MT/BL21 （ DE3 ） 、phoA-MT / BL21（ DE3） 分別經 1 mmol / L IPTG 和低磷酸鹽誘導后，重組可溶表達重組蛋白 SUMO-MT 和His-MT,利用 Ni 離子螯合柱分離純化目的蛋白。
SDS-PAGE 結果顯示 SUMO-MT 和 His-MT 相對分子質量（ Mr） 分別為 26 000 （ SUMO 標簽 Mr19 000,MT Mr7 000） 和 7 000 左 右， 且 蛋 白 純 度 較 高（ 圖 1） .【圖1】
2. 2 抗 MT mAb 雜交瘤細胞株的篩選 選擇免疫后血清抗體效價較高的小鼠進行細胞融合。將狀態良好的 Sp2/0 骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞融合，融合率達 99%.融合后 10 d 左右，待細胞長至孔底的1 /2以上時，取細胞上清采用間接 ELISA 進行交叉篩選。僅選擇與 His-MT 蛋白反應為陽性，而與含His-tag的 IGF 蛋白反應為陰性的克隆，判定為陽性克隆。經初篩、復測，3 次亞克隆培養后，最終篩選獲得2 株能穩定分泌抗華溪蟹 MT 抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為 mAb-MT2 和 mAb-MT3,凍存、保種。
2. 3 IgG 亞類鑒定 按照試劑盒說明操作，2 株雜交瘤細胞株的 DMEM/F12 培養基無血清培養上清經夾心 ELISA 亞類鑒定為 IgG1 亞型。
2. 4 腹水制備及效價測定 將雜交瘤細胞接種于經產 BALB/c 小鼠腹腔，12 d 左右收集腹水。間接ELISA 測定 mAb-MT2 和 mAb-MT3 腹水效價分別為1∶500 000、1∶1000 000.腹水經 HCIC 和蛋白 A 親和層析純化后，得到純度較高的抗 MT mAb（ 圖 2） .【圖2】
2. 5 Western blot 鑒 定 以純化的 mAb 為一抗，AP 標記的山羊抗小鼠 IgG 為二抗進行 Western blot分析鑒定。結果顯示，2 株雜交瘤分泌的 mAb 均能特異性識別重組 SUMO-MT 和 His-MT（ 圖 3） .【圖3】
2. 6 Dot-ELISA 檢 測抗 MT mAb 的 特 異 性Dot-ELISA分析結果表明，2 株 mAb 均能與重組菌PET-28a-SUMO-MT/ BL21（ DE3） 、phoA-MT/ BL21（ DE3） 、重組 SUMO-MT、重組 His-MT 及肝胰腺組織 MT 粗提液反應，具有良好的反應特異性，而與重組 His-IGF、PET-28a-SUMO / BL21（ DE3） 沒有特異反應性（ 表 1） .【表1】
2. 7 mAb 識別的抗原位點分析 利用 ELISA 疊加法分析了 2 株 mAb 的抗原識別位點，結果顯示：mAb-MT2 和 mAb-MT3 疊加后，增殖指數 （ AI ） 為6% ,小于 10% ,說明 mAb-MT2 和 mAb-MT 可能識別同一表位（ 表 2） .【表2】
3 討論
MT 由于分子質量較小，半衰期短，在大腸桿菌體內不穩定且易被酶降解； 富含半胱氨酸，極易形成無生物活性的包涵體和影響宿主體內的氧化還原環境； 易結合金屬離子影響宿主細胞的正常生理代謝、對細胞的毒性以及細胞對金屬離子的耐受性差等問題，成為一種較難獲得重組表達的蛋白.在前期研究中，將河南華溪蟹 MT 基因亞克隆至 PET-28a、PQE30 等一系列常規表達載體上，發現其無法正常表達，這也進一步驗證了 MT 由于其獨特的性質而較難獲得重組表達的推理。為解決這一問題，研究者多利用融合技術將 MT 基因與具有協助蛋白正確折疊的融合蛋白如谷胱甘肽 S 轉移酶 （ glutathioneS-transferase,GST） 融合表達.在前期工作中，利用 GST 表達系統也成功實現了河南華溪蟹的表達，但目的蛋白多以包涵體的形式存在，可溶表達量有限。本研究利用兩種特殊的表達系統： SUMO 融合表達系統和 phoA 分泌表達系統，實現了河南華溪蟹MT 的重組可溶表達。在 SUMO 系統中，MT 通過融合 SUMO tag,利用其促溶、促折疊等特性實現了體外重組可溶表達。而在 phoA 表達系統中，河南華溪蟹 MT 蛋白被分泌表達至細胞周質中，降低了 MT 的細胞毒性，同時細胞周質中氧化還原環境較弱，能夠最大程度的保證 MT 的天然構象，克服了僅帶有6 × His小分子量標簽 MT 的表達困難,實現了其可溶分泌表達。MT 的 Mr較低、免疫原性較差.
SUMO-MT 的成功制備，在最大程度保持 MT 天然構象的基礎上，大大提高了 MT 的免疫原性。同時利用僅帶有較弱免疫原性的6 × His tag 完成了 MT 的重組表達，以 His-MT 作為檢測抗原篩選 mAb,大大提高了抗體篩選的特異性和準確性。在雜交瘤篩選過程中，以 His-MT 作為檢測抗原避免 SUMO tag 假陽性的影響，同時利用 His-IGF 進行交叉篩選也規避了針對 6 × His tag 假陽性，獲得僅針對 MT 的陽性雜交瘤細胞株。同時，重組 SUMO-MT 和 His-MT 均以可溶形式表達，最大程度的保持了 MT 的天然構象，為我們同時篩選針對線性抗原表位和構象表位的 mAb 提供了可能。
本研究通過 2 種不同表達形式實現了河南華溪蟹 MT 蛋白的重組表達，進一步利用 SUMO-MT 良好的免疫原性和 His-MT 較強的特異性，利用雜交瘤技術制備了 mAb.實驗結果表明，制備的 mAb 不僅可以特異性識別重組 SUMO-MT 和 His-MT,而且與內源性組織 MT 也具有良好的反應性?？?MT mAb 的制備，對建立敏感、準確、標準化的免疫學檢測方法及深入研究 MT 的重金屬解毒機制具有重要意義。
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