昆蟲免疫主要是以產生的抗菌肽、抗病毒因子、凝集素、溶菌酶及蛋白酶抑制劑等多種活性物質,配合多種功能的血細胞建立的一個開放防御體系.昆蟲僅具有先天性免疫,不具有適應性免疫.昆蟲的先天免疫系統主要分為細胞免疫和體液免疫2大部分.體液免疫中轉錄因子Rel/ NF-κB介導的信號轉導通路主要有Toll通路和Imd通路[1],昆蟲主要通過這2種通路抵抗微生物的侵染.

研究發現,這2種通路通過激活不同的Rel/ NF-κB家族成員調控不同抗菌肽基因的表達,其中Toll通路主要激活轉錄因子Dorsal和Dif,Imd通路主要激活轉錄因子Relish[1-5].已知的Rel/ NF-κB蛋白家族成員有8種,哺乳動物中有5種,昆蟲細胞中的3種分別是Dorsal、Dif和Relish.其中Dorsal和Dif無錨定重復序列,Relish有錨定重復序列. Rel/ NF-κB蛋白的主要功能是調節機體免疫應答、炎癥反應、細胞凋亡和生長發育,炎癥、癌癥、自身免疫疾病等病理過程與NF-κB的過度活化相關[6].

由于Rel/ NF-κB介導的Toll通路與Imd通路在無脊椎動物和脊椎動物中非常保守[1,7],因此,對昆蟲Rel/ NF-κB的研究不僅能夠系統了解昆蟲的先天免疫機制,而且可為深入了解高等動物的免疫機制及疾病防治提供重要依據.盡管Rel/ NF-κB蛋白在先天免疫過程中起著非常重要的作用,但目前為止尚未見到有關柞蠶Rel/ NF-κB家族成員的報道.本項研究利用生物信息學方法和分子生物學技術,以柞蠶蛹為試驗材料,克隆柞蠶免疫相關基因Apdorsal的全長cDNA序列,并將其編碼的氨基酸序列與其它物種的Rel/ NF-κB氨基酸序列進行比對及構建系統進化樹,利用實時熒光定量PCR技術檢測Apdorsal基因經不同微生物誘導處理后的組織表達變化,為探討柞蠶的先天免疫機制提供參考.

1材料與方法

1.1材料和主要試劑

供試柞蠶品種為青6號,柞蠶蛹由遼寧省蠶業科學研究所惠贈,4 ℃條件下保存備用.大腸桿菌\\(E.coli\\)Top10、枯草芽孢桿菌\\(Bacillus subtilis\\)、畢赤酵母\\(Pichia pastoris\\)、柞蠶核 型 多 角 體 病 毒\\(ApNPV\\)等微生物由本實驗室保存.Trizol試劑,Reverse Transcriptase M-MLV試劑盒,ExTaq酶,凝膠回收試劑盒,pMD18-T載體,T4-DNA連接酶,限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ,RLM-RACE試 劑 盒, SYBR-PrimeScript-RT-PCR Kit\\(Perfect Real Time\\),均購自寶生物工程\\(大連\\)有限公司.

1. 2柞蠶蛹總RNA提取及目的基因的RT-PCR擴增

取20 μL培養過夜的E.coliTop10,注射到柞蠶蛹體內,12 h后解剖取脂肪體組織,用Trizol試劑提取柞蠶蛹脂肪體總RNA,然后按照Reverse Tran-scriptase M-MLV試劑盒說明書將提取的總RNA反轉錄成cDNA.

根據GeneBank登錄的煙草天蛾Dorsal\\(登錄號:ADK39025\\)、家蠶Rel\\(登錄號:NP_001036896\\)和岡比亞按蚊Rel\\(登錄號:XP_310177\\)的cDNA序列設計簡并引物F\\(5′-TGCGARGGMCGSTCGG-3′\\)、R[\\(5′-CATKGCCTTCTTRTCG\\(T/ A\\) AGATG-3′\\)].簡并引物F/ R進行cDNA片段擴增,反應條件如下:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性3 s,55 ℃退火30s,72 ℃延伸30 s,35個循環;72 ℃終延伸7 min.PCR產物經電泳檢測后純化回收,連接到pMD18-T載體,轉化E.coliTop10感受態細胞,通過酶切鑒定篩選陽性克隆,送至寶生物工程\\(大連\\)有限公司進行測序分析.

1. 3目的基因的RLM-RACE擴增

根據"1. 2"中擴增得到的cDNA序列設計RACE擴增特異引物:Dor-5′RACE outer primer\\(5′-CCAGGTTGTGCGAGTGAGGC-3′\\),Dor-5′RACE innerprimer\\(5′-ATTGTAGGGTAGGTGCGGTTCTCG-3′\\),Dor-3′RACE outer primer\\(5′-CTCGGCATCCAGTGCGTCAA-3′\\),Dor-3′RACE inner primer\\(5′-GGAATCACCCGC-AGAGCATC-3′\\). 5′-RACE和3′-RACE擴增分別按照RLM-RACE試劑盒說明書進行,PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳、純化回收后連接到pMD18-T載體,轉化E.coliTop10感受態細胞,通過酶切鑒定篩選陽性克隆,送至寶生物工程\\(大連\\)有限公司進行測序.

1.4目的基因的序列分析

測序結果用GenBank的BLAST比對,并用在線軟件Expasy進行蛋白質分子質量和等電點分析.獲得的柞蠶Dorsal基因用在線軟件BLASTW進行氨基酸序列同源性比對,并用MEGA5. 0軟件構建系統進化樹.

1. 5不同微生物對柞蠶蛹的誘導處理及各組織總RNA提取

取30只健康柞蠶蛹隨機分為5組,每組6只,雌雄各3只.第1組為空白對照;第2組注射50 μLE.coliTop10[D\\(600 nm\\)= 1. 2,用無菌水稀釋 10倍];第3組注射50 μL枯草芽孢桿菌[D\\(600 nm\\)=1. 2,用無菌水稀釋10倍];第4組注射50 μL畢赤酵母[D\\(600 nm\\)= 1. 2,用無菌水稀釋 10 倍];第 5組注射50 μL ApNPV\\(2×106mL-1病毒懸液,用無菌水稀釋10倍\\).用一次性無菌注射器從柞蠶蛹第1腹節處注射,常溫孵育24 h后,分別取柞蠶蛹的表皮、生殖腺、脂肪體、血淋巴、頭部、氣管6個組織器官,加液氮研磨成粉后,用Trizol試劑提取總RNA,然后按照Reverse Transcriptase M-MLV說明書將提取的總RNA反轉錄成cDNA.

1. 6目的基因表達的實時熒光定量PCR檢測

1. 6. 1引物設計 根據獲得的柞蠶Dorsal基因序列設計real-time PCR引物: QTF-ApdorsalA\\(5′-AG-GATCATTTACGCTGGAGGTACG-3′\\), QTR-ApdorsalA\\(5′-CTTCTCAGTTTCAACAGGTGTCCG-3′\\);QTF-Ap-dorsalB \\( 5′-TGCGCGAGTGTCAGTGTAGTTTGA-3′\\),QTR-ApdorsalB\\(5′-CGCAGTGTTCGCTTCCAAGAA-TCA-3′\\).以組成型表達的柞蠶β-actin基因作為內參,引物為:A3F\\(5′-ACCAACTGGGACGACATGGA-GAAA-3′\\),A3R\\(5′-TCTCTCTGTTGGCCTTTGGGT-TGA-3′\\).

1. 6. 2實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR反應采用熒光染料SYBR Green\\(R\\)Ⅰ在Rotor Gene3000-6實時熒光定量基因擴增儀\\(上海天呈科技有限公司\\)上進行.按照SYBR-PrimeScript-RT-PCRKit說明書配制25 μL反應體系:cDNA模板2 μL,2×SYBR Premix ExTaq酶12. 5 μL,10 μmol/ L正向引物0. 5 μL,10 μmol/ L反向引物0. 5 μL,RNaseFree dH2O 9. 5 μL. PCR反應條件: 95 ℃預變性30s,30個循環\\(95 ℃變性3~5 s,60 ℃退火/延伸20s\\).

反應結束后,20 min緩慢升溫繪制熔解曲線,利用Botor Gene 6軟件的2-ΔΔCt方法[8]對目標基因的表達水平進行分析.

2 結果與分析

2.1 Apdorsal基因的獲得與序列特征

利用RLM-RACE擴增從柞蠶蛹脂肪體中克隆得到了2個Apdorsal基因的cDNA序列,分別命名為ApdorsalA和ApdorsalB \\(登 錄 號: JF488068、JF488069\\).其中,ApdorsalA的cDNA全長1 872bp,有一個1 158 bp的開放閱讀框\\(266~1 423 nt\\),編碼386個氨基酸,該cDNA還包括265 bp的5′端非編碼區和449 bp的3′端非編碼區;ApdorsalB的cDNA全長1 860 bp,有一個1 008 bp的開放閱讀框\\(404~1 411 nt\\),編碼336個氨基酸,該cDNA還包括403 bp的5′端非編碼區和449 bp的3′端非編碼區.

推導的氨基酸序列中都包含Rel/ NF-κB蛋白家族的特征區RHD,但是3′端沒有Dorsal蛋白通常所具有的TD轉錄激活區\\(圖1\\).

將ApdorsalA蛋白與其它物種的Rel/ NF-κB家族蛋白進行全長氨基酸序列比對,結果顯示柞蠶ApdorsalA蛋白與Dorsal、Dif、P65都屬于無錨定重復 序 列 的 一 類 蛋 白, ApdorsalA與 煙 草 天 蛾MsDorsal、家蠶BmRelA、岡比亞按蚊Gambif、皺紋盤鮑AbRel、人Hsp65、褐家鼠Rnp65、果蠅DmDif、家蠶BmReish1和果蠅DmRelish的序列相似度分別為78%、70%、56%、48%、45%、45%、41%、32%、34%.

應用MEGA5. 0軟件構建柞蠶ApdorsalA蛋白與其它物種Rel/ NF-κB蛋白的系統進化樹,結果顯示ApdorsalA蛋白與煙草天蛾Msdorsal、家蠶BmRelA蛋白有較近的親緣關系\\(圖2\\).

2.2 Apdorsal基因mRNA組織分布及不同微生物誘導的表達變化

為了進一步了解Apdorsal基因在柞蠶不同組織中的表達情況及Apdorsal是否參與了對不同微生物的免疫應答反應,利用real-time PCR技術以柞蠶β-actin基因為內參檢測各種組織中ApdorsalA和ApdorsalB基因mRNA的轉錄情況.結果表明2個Apdorsal基因mRNA在柞蠶蛹各組織中都有轉錄,在表皮和氣管中的轉錄水平最高,在脂肪體和頭部中的轉錄水平次之,在血淋巴中的轉錄水平較低.柞蠶蛹脂肪體中的Apdorsal基因mRNA經ApNPV誘導處理后的轉錄水平最高,經畢赤酵母和枯草芽孢桿菌誘導處理后的轉錄水平次之,經E.coli誘導處理后的轉錄水平最低\\(圖3\\).

3 討論

本實驗克隆得到了2個編碼柞蠶Dorsal蛋白的cDNA序列,二者的5′端部分序列不同,推導的氨基酸序列僅僅是N端的50個氨基酸殘基有差異.出現這種現象可能是由于可變剪切的結果,在其它物種的研究中也出現過由于可變剪切編碼不同Rel/ NF-κB蛋白的現象,例如家蠶BmRelA和BmRelB的氨基酸序列也僅是N端52個氨基酸殘基有差異[9].本實驗克隆的2個Apdorsal基因的編碼蛋白質都有典型的Rel/ NF-κB蛋白特征,N端含有由293個氨基酸組成的Rel同源區\\(RHD\\),其中包括核定位信號\\(NLS\\)和DNA結合結構域等基序. Apdorsal C末端與果蠅和家蠶的Relish[10-11]不同的是該區域中沒有錨定重復序列.雖然Apdorsal的結構特征與BmRelA[9]和Gambif1[12]類似,但不具有BmRelA和Gambif1的亮氨酸鋅指結構與脯氨酸富集區.值得注意的是,Apdorsal有一個相對較短的C末端片段,這與典型的Dorsal蛋白不同,而且Apdorsal也沒有典型的Dorsal轉錄激活域,這可能是可變剪切造成的[13].

從系統進化樹中可以看出,Apdorsal與家蠶BmRelA和煙草天蛾Msdorsal有很近的親緣關系,同屬于Rel/ NF-κB蛋白家族的Dorsal類,表明它們可能起源于同一個祖先.應用real-time PCR技術檢測到2個Apdorsal基因在柞蠶蛹脂肪體、血細胞、氣管、表皮、生殖腺和頭部6個組織器官中都有表達,體現了該蛋白質在柞蠶中的多功能性[6].Apdorsal基因在表皮和氣管中的表達量最高,在脂肪體和頭部中的表達量次之,在血淋巴中的表達量較低,這是由于表皮是昆蟲抵御微生物感染的第一道防線,而脂肪體是參與免疫應答的重要組織器官.用不同微生物誘導處理柞蠶蛹后,部分組織中Apdorsal基因的表達量比空白對照偏低,出現這種現象的原因可能是注射處理過程中物理性傷害產生的抑制作用,這與家蠶注射NaCl溶液后各組織中的BmToll9基因的表達量出現降低的結果相一致[14].

柞蠶蛹脂肪體中的Apdorsal基因經ApNPV誘導處理后的表達水平最高,經畢赤酵母和枯草芽孢桿菌誘導處理后的表達水平次之,經E.coli誘導處理后的表達水平最低.該結果說明柞蠶蛹脂肪體中的Apdorsal可能與對病毒、真菌、革蘭陽性菌的免疫有關,而與對革蘭陰性菌的免疫無關.這與Dorsal蛋白在Toll通路中對革蘭陽性菌和真菌侵染具有抵抗作用的研究結果一致[1,8].對于病毒侵染昆蟲后是否激活了NF-κB信號通路尚無定論.已有文獻報道Toll樣受體\\(TLRs\\)參與了病毒的識別,進而激活Toll通路[15];Zambon等[16]也報道果蠅在抵抗病毒侵染的過程中通過激活Toll通路產生抗菌肽\\(AMPs\\),但不是通過AMPs抗病毒,而是由Toll通路激活細胞免疫殺滅病毒,說明病毒侵染可能會使Toll通路中的Dorsal的表達量增加.

這與本實驗對柞蠶蛹注射ApNPV懸液后脂肪體中的Apdorsal基因的表達量增加的結果相一致.然而Hirai等[17]用病毒侵染柞蠶后未檢測到抗菌肽Attacin基因的表達,認為病毒不能激活NF-κB信號通路.對于病毒是否激活NF-κB信號通路及病毒侵染使Apdorsal表達量增加的分子機制仍需繼續探究.

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