人組織激肽釋放酶\\( TK\\) 作為人激肽釋放酶-緩激肽\\( KKS\\) 系統中的一個關鍵酶,能通過裂解低分子量激肽原釋放緩激肽和激肽類物質,進而與血管壁和其他部位的內皮平滑肌細胞上的緩激肽受體 2\\( B2\\) 結合,激活一氧化氮-環磷酸腺苷\\( NO-cAMP\\)和前列環素-環磷酸腺苷\\( Prostacyclin-cAMP\\) 等信號通路,觸發一系列生物活性效應,包括血管舒張、平滑肌收縮和舒張、抑制凋亡、炎癥、增殖、肥大和纖維化,及促進血管生成和神經發生等[1,2].由于 B2 受體廣泛存在于人體內的組織及細胞中,如平滑肌細胞、神經細胞、腎小管上皮細胞和心肌細胞中[3],因此 TK 具有廣泛的生物效應并可能在心腦血管疾病的發生發展中具有廣泛的應用前景.本研究利用生物信息學預測 TK 蛋白可能的高級結構、親水性和抗原性高低,根據分析結果,選取預測抗原性較高、與已知蛋白同源性低的多肽片段,將其免疫家兔,制備針對 TK 不同抗原表位的多克隆抗體,為 TK 檢測試劑盒的制備以及進一步研究 TK 在心腦血管疾病發生發展的作用及機制奠定了基礎.
1 材料與方法.
1. 1 主要材料 日本大耳白\\( 2 kg\\) 購自華中科技.
大學同濟醫學院實驗中心; 血藍蛋白\\( KLH\\) 、戊二醛、弗氏完全佐劑\\( FCA\\) 、弗氏完全佐劑\\( FIA\\) 、TMB 購自 Sigma 公司; 牛血清白蛋白 \\( BSA\\) 、甘氨酸、HRP 標記羊抗兔 IgG 購自武漢凌飛生物有限公司; 抗體親和層析試劑盒購自 PIERCE 公司; TK-4T1融合蛋白為本實驗室生產[4]; 預染的蛋白質分子量標準購自 Fermentas\\( MBI\\) 公司; PVDF 膜購自德國Schleicher&Schuell 公司; 化學發光試劑 ECL 購自PIERCE 公司; 凝膠成像系統\\( Gene Genius Bio Ima-ging System\\) 為 Synegene 公司產品; Western blot 設備為 Biorad 公司產品.
1. 2 生物信息學分析 登錄進入采用 Blastn 和 Blastx 程序,進行同源性檢索和保守性分析.采用 ProtScale 程序、ExPASy工具包程序、SWISS PROT 蛋白數據庫和 DNA star\\( Protean\\) 生物信息學軟件對 TK\\( KLK1\\) 的二級結構、抗原性、親疏水性、結合位點、氨基酸的帶電性等理化性質進行分析.
1. 3 TK 多肽的設計與免疫原及包被原的合成.TK 是位于人類染色體 19q13. 13 ~ 19q13. 14 上的一段絲氨酸蛋白酶\\( 圖 1\\) ,由 262 個氨基酸組成.我們根據生物信息學分析和預測,按抗原性、親疏水性和同源性分析,分別設計了位于 TK 頭端的含 11 個氨基酸的多肽 \\( 11P: AC-Glu-Asn-His-Thr-Arg-Gln-Ala-Asp-Glu-Asp-Thr-COOH\\) 和位于 TK 尾端含 12個氨 基 酸 的 多 肽 \\( 12P: NH2-Cys-Lys-Trp-Ile-Glu-Asp-Thr-Ile-Ala-Glu-Asn-Ser-COOH\\) \\( 圖 2 \\) . 多肽的合成和純化由西安美聯公司完成\\( 純度為 98%\\) .
首先稱取 10 mg 多肽溶于 1 ml PBS,取其中 700 μl置于 10 ml 試管中,分別加入 1 ml KLH 及 BSA,然后緩慢加入0. 3%戊二醛,室溫下振搖2 h 直至反應液變為黃色,加入 1 mmol/L 甘氨酸 125 μl 終止反應.30 min 后將所有反應液體裝入透析袋內,并將透析袋置于 2 L PBS 中,在 4℃充分透析,隔日更換PBS 繼續透析 4 h.分裝包被原 \\( 11P-KLH; 12P-KLH\\) 及反應原\\( 11P-BSA; 12P-BSA\\) ,- 20℃ 保存.
1. 4 TK 多克隆抗體的制備及純化 分別取多肽免疫原\\( 11P-KLH; 12P-KLH\\) 與等量弗氏完全佐劑充分乳化,按 300 μg/只的劑量對家兔進行背部皮內多點注射,3 周后,將免疫原與等量弗氏不完全佐劑充分乳化,并用同樣的方法免疫小鼠,以后每隔 3 周免疫 1 次,共免疫 3 次.末次免疫后 7 d 于耳緣靜脈取血,試血達理想效價后頸動脈放血,收集兔血清并進行親和層析純化.
1. 5 TK 多克隆抗體效價及抗原表位分析 利用間接 ELISA 法來測定 TK 兔抗血清的效價.以包被原為固相,加入倍比稀釋的兔抗清及 HRP 標記的羊抗兔抗體,以1∶ 200稀釋的正常兔血清作為陰性對照,應用間接 ELISA 方法以 TMB 為底物測定 OD450nm值,以\\( 被檢標本值 - 空白對照值\\) /\\( 陰性對照值 -空白對照值\\) 即 P/N ≥2. 1 為陽性.采用間接ELISA 相加實驗進行測定.以 TK-4T1 融合蛋白為抗原包被酶標板,前兩孔分別加入上述兩種多抗\\( 抗11P 及抗12P\\) ,其 OD 值分別記錄為 A1 和 A2,第 3 孔先以其中一種飽和量的多抗于 37℃ 作用 1h,洗滌后再與另一種多抗作用 1 h.洗滌后,加入HRP 標記的羊抗鼠 IgG,于 37℃ 保溫 30 min,洗滌后加 TMB 顯色,A450 值記錄為 A1 +2,計算相加指數:AI =[2A1 + 2 / \\( A1 + A2 \\) - 1] × 100% .每組 做 3 個復孔,取其平均值.AI >50% 者,即認為這兩種多抗識別 TK 不同的抗原表位.
1. 6 TK 多克隆抗體的特異性及純度檢測 我們將TK-4T1 與純化后的 TK 多克隆抗體行 Western blot檢測以鑒定多克隆抗體的特異性.然后利用 SDS-PAGE 檢測多抗的純化效果.
2 結果.
2. 1 多肽抗體的制備和效價 家兔免疫后獲得的血清進行倍比稀釋,以 P/N≥,2. 1 為陽性,間接ELISA 測定效價均達 1∶ 25 600 以上,表明獲得高效價的多抗.
2. 2 抗原表位分析 經間接 ELISA 法檢測,A1 的均值為 0. 79,A2 的均值為 0. 92,A\\( 1 +2\\) 的均值為1. 58; 抗 11P 與抗 12P 的相加指數為 0. 85% ,其值大于 50%.因此抗 11P 與抗 12P 識別不同的抗原表位.
2. 3 多肽抗體的特異性 為了檢測兔血清的特異性,我 們 分 別 將 TK-4T1 融 合 蛋 白 和 陰 性 對 照PEGX-4T1 轉印至 PVDF 膜上,然后將分別將純化后的抗體稀釋到 1∶ 8 000 倍進行 Western blot 印跡分析,結果均顯示轉印至 PVDF 膜上的 TK-4T1 蛋白與免疫兔血清在 Mr 約55 kD 處形成單一陽性染色帶,與 TK-4T1 蛋白分子量的理論值相符,而陰性對照處則無條帶出現,表明獲得了抗 TK 的多克隆抗體\\( 圖 3\\) .
2. 4 多肽抗體的純度 利用親和層析法分別純化了抗 11P 與抗 12P,并采用回收的抗體樣本做了SDS-PAGE 染色,結果均發現了清晰的兩條帶\\( 輕鏈和重鏈\\) 且未見雜帶.因此,該抗體的純化率為100% \\( 圖 4\\) .
3 討論.
人組織激肽釋放酶是一類絲氨酸蛋白酶,位于人類染色體 19q13. 13 ~ 19q13. 14 上,因編碼不同的絲氨酸蛋白酶而具有不同的功能.人組織激肽釋放酶由 15 個成員組成.人和動物的組織激肽釋放酶中只有一種酶能有效地使激肽原釋放生物活性物激肽即為 TK[5].我們前期制備 TK 多抗的方法是采用構建原核表達載體,在大腸桿菌中表達并純化圖 4 TK 多克隆抗體經親和層析純化后的 SDA-PAGEFig. 4 SDA-PAGE of affinity chromatography for poly-clonal antibodiesNote: M. Protein marker; 1. Anti-11P; 2. Anti-12P.
融合蛋白\\( TK-4T1\\) ,隨后免疫動物制備抗血清[4].鑒于利用融合蛋白制備抗體的過程繁瑣,費時費力,特異性不理想,不利于我們進一步進行 TK 相關的臨床研究.因此我們利用信息學在基因識別、蛋白質功能預測、蛋白質生理范圍的確定、蛋白質高級結構的預測等方面的重要作用來對 TK 的抗原性、跨膜結構域、二級結構、疏水性、結合位點、氨基酸的帶電性、所選擇氨基酸偏堿性和偏酸性及多肽的合成難易等進行分析[6].充分評估這些因素后我們選擇了針對 TK 不同表位的兩條多肽來制備針對 TK不同表位的多克隆抗體.由于合成的多肽純度均高達 98%,并且是針對 TK 一段表位的,因此其可能具有較高的效價及純度,并具有較強的特異性.
我們的結果證實利用這兩條肽段制備的多抗均具有較高的效價及較強的特異性,并且是針對 TK不同表位的抗體,經純化后,這兩種抗體的純度均為100% .這說明我們的多抗制備是非常成功的.此外,由于這兩種抗體是針對 TK 不同表位的,我們可以將這兩種抗體應用于 TK 的雙抗體夾心 ELISA 試劑盒的制備及其他 TK 相關臨床及基礎研究.汪道文教授的團隊及和 Lee Chao 等人通過使用轉基因的方法使激肽釋放酶-激肽在體內的持續供應,發現KKS 系統具有抗高血壓,2 型糖尿病的胰島素抵抗的作用及通過抑制氧化應激來發揮心血管、腎臟和中樞神經系統的保護作用[2,7].直接輸注 TK 的基因或蛋白可以直接改善心功能、腎功能和神經功能而不伴有血壓的降低.還有研究證明,過表達的 TK能減輕 2 糖尿病誘導的高血壓和腎臟損害.此外,體外研究和動物實驗均證明 TK 具有防護缺血性腦卒中的作用[2,9].我們前期的一項大規模的多中心研究亦證實血漿中 TK 的含量與腦卒中及其復發呈負相關關系,并且血漿中 TK 含量高的患者具有較長的無癥狀生存期[4].這一系列的研究進一步證實了 TK 在心腦血管及腎臟疾病的診斷和治療方面可能具有廣闊的應用前景,也說明了開發 TK 相關產品的潛在應用價值.總之,我們通過合成肽來制備針對 TK 不同表位的多克隆抗體不僅提供了一種簡便的行之有效的方法,還為 TK 相關產品的開發以及 TK 相關基礎及臨床研究提供了一定的實驗基礎.
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