假性軟骨發育不全\\(PSACH\\)是一種以骨骼發育異常、身材矮小為特征的遺傳性骨骼疾病,以常染色體顯性遺傳方式進行,外顯率100%。PSACH患者中80%以上均屬散發病例,由基因突變產生;不到10%患者則由家系遺傳所引起。據文獻統計,該病全球發病率為1/1.5萬~1/2萬,在中國的發病率更低,且對該病的研究與報道非常少見。軟骨寡聚基質蛋白\\(COMP\\)基因是目前唯一報道的與PSACH發生有關的致病基因。在中國,PSACH患者很少,相關研究人員對此病了解較少,因而很少有文獻對PSACH患者COMP基因突變進行研究、分析與報道。本研究通過基因測序方法對1例PSACH患者及其父母COMP基因進行突變分析。
1、資料與方法
1.1研究對象本實驗以1例初步診斷為PSACH患者及其父母為研究對象,共3人?；颊吲?年齡5歲,身高約107cm,臨床表現為四肢短小、頭大、前額突出、塌鼻梁,肘關節不能伸直且關節疼痛,脊椎發生側彎,并且走路時出現典型的鴨步?；颊吒改妇鶠檎Ｈ?沒有發病癥狀。上述參與實驗人員均獲得并簽署了知情同意書,自愿提供自己的DNA為研究樣本。
1.2研究方法外周血DNA提取:分別抽取上述患者及其父母外周靜脈血2~3ml\\(EDTA抗凝混勻\\),采用美國Omega生物技術公司DNA提取試劑盒\\(BloodDNAMidiKit\\)從血液中提取DNA,用紫外分光光度計對DNA進行檢測,A260/A280約為1.84。
引物序列設計:本實驗所使用的引物是文獻報道中針對外顯子8-19序列聚合酶鏈式反應\\(PCR\\)擴增所需要的引物。引物序列及退火溫度如表1所示。PCR擴增:采用日本Takara公司PCR擴增試劑盒\\(PCRAmplificationKit\\)。每個反應的總體積為25μl,反應體系內包括DNA模板50~200ng、上游引物與下游引物各1μmol/L、dNTP各200μmol/L、MgCl21.5mmol/L,10×PCR緩沖液2.5μl、TaqDNA聚合酶1U,其余用水補齊。采用PTC-200常規PCR擴增儀,PCR操作如下:95℃預變性5min,94℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,循環35個周期,最后72℃延伸10min。PCR操作結束后電泳跑膠,觀察PCR擴增結果。電泳結果如圖1所示。
PCR擴增產物純化及其測序:采用德國Qiagen公司QIAquickPCRPurificationKit試劑盒,將擴增好的PCR產物用純化試劑盒進行純化,去除產物中非特異性擴增產物及其引物二聚體等雜質。將純化好的產物送測序部,使用美國ABI公司的3730XL測序儀對純化產物進行測序。
2、結果
對1例PSACH患者及其父母COMP基因8-19號外顯子進行測序篩查發現,患者第9號外顯子上出現異常\\(雜合套鋒\\),經分析為c.925G>A,該堿基突變導致第309位氨基酸由甘氨酸\\(Gly\\)轉變為精氨酸\\(Arg\\),而在其父母相同位點處并沒有發現堿基突變。進一步研究分析發現,該突變c.925G>A在國內相關文獻中未見報道,國外相關文獻中也少有對該位點突變的報道。圖2為突變位點的基因測序峰圖。
3、討論
3.1COMP基因與PSACH相關性
PSACH是一種以骨骼發育異常為特征的骨骼疾病,主要由基因突變引起,目前世界公認的致病基因是COMP。1993年,Briggs等、Hecht等分別報道將COMP基因定位于19號染色體上。該基因為26Kb,相對分子質量為550000,由19個外顯子和18個內含子組成,包括8個類鈣調蛋白T3重復區\\(CLR\\),4個Ⅱ型類表皮細胞生長因子T2重復區\\(EGFR\\),1個螺旋區和1個羧基末端球狀區\\(CTD\\)。在這些區域中,CLR是與PSACH關系最密切區域。據目前相關文獻報道,超過80%致病突變堿基均在該區域中發現,且還有可能存在未發現的突變堿基;該區域還具有較強的Ca2+結合能力,如果在該區域內發生堿基突變,可能會導致基質蛋白不能很好地與Ca2+結合,阻礙軟骨細胞分化。
COMP主要分布在軟骨細胞的細胞外基質中,當其功能發生改變后,可影響蛋白之間的相互作用,減弱蛋白上的電荷極性,從而引起蛋白迅速沉降或分解,導致軟骨細胞分化終止或凋亡,延緩骨骼線性生長。Dinser等經牛軟骨細胞內COMP突變研究發現,COMP基因突變導致軟骨細胞分泌延遲,同時在細胞外基質中形成一定數量的非晶體聚合物,可顯著較低軟骨細胞存活能力,繼而發生軟骨細胞凋亡。
Posey等經基因操作法檢測COMP堿基突變小鼠體內軟骨細胞表達,結果發現體內軟骨細胞凋亡速度明顯增加,且細胞外基質蛋白在基質內明顯滯留。還有一些研究發現,COMP有可能在基質組裝中發揮著重要作用,當COMP發生堿基突變,軟骨細胞基質中離子通路發生改變,引起基質中部分蛋白含量急劇減少,間接導致PSACH產生。
與PSACH相關的致病突變堿基,目前報道有90多個。超過97%突變位點均定位于8-19號外顯子所編碼區域。本實驗針對8-19號外顯子序列設計引物及其PCR擴增,經測序篩查后發現該患者第9號外顯子發生了堿基突變\\(c.925G>A\\),導致第309位甘氨酸\\(Gly\\)轉變為精氨酸\\(Arg\\)。該堿基突變尚未在國內人群中發現,國外也僅有少量文獻報道。
Kennedy等于2005年報道1例PSACH患者,在其COMP基因第9號外顯子上發現c.925G>A,結果導致p.Gly309Arg。Nakayama等于2003年報道1例日本PSACH患者,在其COMP基因第9號外顯子上發現c.925G>C,同樣導致p.Gly309Arg。研究分析提示,此堿基突變位點不在保守序列區內,因而有可能堿基替換后阻礙了COMP轉錄精確性,引起編碼蛋白質C末端發生變化,導致PSACH產生。目前國內外對該突變位點的報道較少,尚需進一步研究分析該位點堿基突變與PSACH相關性。
3.2國內診斷PSACH方法
國內對PSACH的診斷與研究還處于較低水平,臨床醫生大多根據疑似患者的臨床表現及放射學特征診斷PSACH。這種診斷方法存在一定的誤診或漏診風險,主要原因在于:PSACH臨床癥狀與軟骨發育不全或干骺端發育不良十分相似,均屬骨骼發育障礙引起的身材矮小,因而給診斷帶來困難;PSACH發病較晚,一般在3歲以后才會出現典型癥狀,既不利于疾病預防與治療,又可能造成早期患兒的誤診或漏診。據不完全統計,國內2010年前總共發現24例PSACH患者,均是依據患者臨床表現及放射學特征。然而國內人口基數很大,PSACH患者人數遠不止24例,因而可能有更多PSACH患者被漏診或誤診?；驕y序是目前國內外檢測PSACH的金標準,通過篩查COMP基因突變,找到突變位點來確診PSACH。隨著PSACH研究逐步深入,2010年后基因測序越來越多地應用于突變堿基篩查,PSACH患者確診率因而得到提升?；驕y序方法還可應用于產前診斷。
PSACH屬于單基因突變遺傳性疾病,無法進行有效治療,如果在產前能診斷出胎兒基因突變并確診,既可有效預防PSACH患者出生,保證胎兒健康狀況,又可減輕胎兒家庭壓力與負擔。因此,基因診斷必將成為一種重要診斷方法得到臨床廣泛推廣與應用,尤其在胎兒產前診斷與罕少見遺傳病診斷方面。
