有汗性外胚葉發育不良\\(Hidrotic ectodermal dys?plasia, HED，MIM 129500\\)是一種以甲、毛發及掌跖\\(或牙齒\\)等外胚層起源的組織發育缺陷為主要特征的常染色體顯性遺傳皮膚病。1929年，Clouston報告了一個法籍加拿大家系患有該病后，引起了人們的重視，后又稱其為Clouston綜合征。該病典型的臨床表現有指（趾）甲營養不良、部分或完全脫發、掌跖部皮膚角化過度、牙齒發育不全，部分患者可出現白內障、斜視、骨骼改變、聽力減退、指\\(跖\\)畸形，少數有癲癇發作、智力障礙、神經性耳聾等。汗腺和皮脂腺功能通常正常。由于受遺傳和環境等多方面因素影響，這些癥狀不一定同時存在，有的僅有其中1~2種表現，導致臨床上有時難以明確診斷。目前研究已證實GJB6基因為該綜合征的致病基因。我們采用聚合酶鏈反應和DNA直接測序法，對1例可疑HED的患者進行了基因突變檢測，為產前診斷和遺傳咨詢提供依據。
1、 對象與方法
1.1 研究對象 患者，男，13歲，2008年就診于安徽醫科大學第一附屬醫院，其母親訴患者出生后即發現眉毛和頭發缺失。后眉毛和頭發部分長出，呈稀疏、黃、軟，但仍呈部分缺失，且甲漸增厚?；颊吒改赣H、妹妹和其他家族成員均無類似表現?；颊吒改阜墙H結婚。體檢：一般情況，發育及智力正常，口腔粘膜及牙齒正常，部分眉毛、后枕部頭發缺如，指\\(趾\\)甲遠端1/3稍增厚\\(見圖1\\)；汗腺和皮脂腺分泌正常，掌跖部未見明顯異常。甲屑真菌鏡檢及培養均為陰性?；颊叱踉\為“先天性厚甲癥”，經篩查先天性厚甲癥的K6a、K6b、K16和K17基因無異常突變后，排除了先天性厚甲癥。后經國際厚甲組織成員Frances博士等專家義診，認為該患者為HED，需進行GJB6基因檢測。
1.2 方法
1.2.1 外周血DNA的提取 在取得患者及家屬的知情同意后，抽取患者及家庭中正常人的靜脈血2mL置于EDTA抗凝管中。采用基因組DNA快速抽提純化試劑盒（上海生工生物工程技術有限公司）提取基因組DNA，同時提取100例健康對照者\\(均為門診隨機挑選的非外胚葉發育不良無血緣關系的患者\\) DNA。
部分患者的DNA帶到英國Ninewells醫學院分子和細胞病理學系實驗室由Frances博士檢測。
1.2.2 引物設計 根據文獻合成引物的序列：正向：5’-GGACGCTGCACACTTTCATC-3’；反向：5’-GCTTGGGAAACCTGTGATTG-3’，引物由上海生工生物工程技術有限公司合成，引物采用PAGE純化后稀釋為20μmoL/L備用。
1.2.3 PCR 擴增 擴增條件：94℃預變性 5min 后，94℃變性45S，56～64℃復性45S，72℃延伸45S，共30個循環，72℃后延伸10min，1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物。PCR擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用Exonl和SAP酶切純化，將純化產物進行測序PCR反應，然后再進行測序前純化。
1.2.4 DNA測序 直接測序 將測序PCR純化產物上樣，經CEQ8800型DNA全自動測序儀\\(美國貝克曼庫爾特公司\\)直接測序，測序結果采用Chromas 2.0軟件對基因序列進行對比分析，確定突變位點。
2、 結果
我們與Frances的測序結果均發現：患者GJB6基因上第31位堿基發生雜合突變，鳥嘌呤\\(G\\)被腺嘌呤\\(A\\)取代；由此，第11位氨基酸密碼子由GGG突變成AGG，導致正常的甘氨酸\\(G\\)被精氨酸\\(R\\)替代，即G11R突變\\(見圖2\\)。而對患者家庭中的正常人和100例健康對照進行GJB6基因的突變篩查，并沒有發現同樣的堿基改變，說明該突變是致病突變而不是單核苷酸多態性\\(SNP\\)。
3、 討論
有汗性外胚葉發育不良是一種以毛發、牙齒、汗腺、甲發育異常為特征的常染色體遺傳性疾病。發病率約為1/100 000。最初的文獻報道多見于法籍加拿大人，后來各種族中均有報道。由于臨床表現多變，多數癥狀不典型，特別是與一些臨床癥狀有交叉的疾病易混淆，如：先天性厚甲癥。先天性厚甲癥主要由角蛋白\\(K6a、K6b、K16和 K17\\)基因突變引起，早期的研究提示HED亦可能是由于角蛋白缺陷引起的疾病。后來，幾個相互獨立的研究小組通過遺傳連鎖分析的方法排除了角蛋白基因族為致病基因。通過全基因組關聯分析將致病基因定位在（13q11±12.1）區域內的基因，并通過獨立的精細定位研究得以證實。位于該區域內的兩個候選基因為GJB6及GJB2，分別編碼縫隙連接蛋白30（Cx30\\)和縫隙連接蛋白26\\(Cx26\\)。隨后，GJB2作為HED的候選基因被排除。
2000年Lamartine等發現HED與GJB2有關，并在2個HED 家系中檢測出 G11R 和 A88V 突變，從而證實GJB6基因為HED的致病基因?？p隙連接蛋白30是構成相鄰細胞間縫隙連接通道的蛋白族成員之一。連接蛋白有保守的結構模式：四個跨膜域，兩個細胞外領域和三個胞質域\\(見圖3\\)?？p隙連接允許分子量小的離子、代謝物及一些第二信使\\(cAMP、Ca2+、IP3\\)通過，這些離子和小分子代謝物對細胞生長和各種組織的分化至關重要。GJB6基因與表皮、毛發、指甲、大腦和/或內耳的多種遺傳性疾病相關。GJB6基因突變后，Cx30蛋白結構異常，導致在細胞表面形成連接蛋白半通道功能異常，生成ATP向細胞外介質泄漏，這樣增加ATP含量可能會作為旁分泌信使，改變了控制角化細胞的增殖和分化，導致HED表皮因素的改變。GJB6基因發現與耳聾疾病相關，一些HED患者中也存在聽力損害的報道，但GJB6基因如何引起不同疾病的發病機制至今不清。
在過去的幾十年里，除了多次發現G11R和A88V突變與HED相關外，Frances等人在2002年發現一新突變V37E和Baris等人在2008年發現另一個新的突變 D50N。目前 G11R、V37E、D50N 和 A88V 是迄今發現HED患者的4個突變，分別導致非同義替換氨基酸在N端尾蛋白、跨膜域，細胞外的領域\\(圖3\\)，除我們報道的這例G11R突變外，目前國內仍有兩例G11R突變報道。值得一提的是G11R突變是在亞洲人群HED中發現的唯一突變。
綜上，本研究不僅發現了G11R突變，而且為該家系進行產前診斷和遺傳咨詢奠定了基礎，同時提示我們已發現的突變點對確診可疑病例具有重要意義。
致謝 感謝國際厚甲組織對患者的資助；感謝國際厚甲組織成員Frances Smith博士給予的技術支持和突變驗證。
