1 簡介

隨著比較基因組雜交芯片以及單核苷酸多樣性微陣列分析等微陣列技術在臨床上的應用,實驗室對于患者在發育遲緩/智力障礙\\(DD/ID\\)、先天畸形以及異形的評價體系在近幾年產生了很大的變化。

患者基因組中無法用經典G顯帶方法檢測的小缺失和小重復,現在都能用這些方法檢測到。由于這些年全基因組拷貝數微陣列技術在臨床應用的日漸廣泛,我們在這里對相關指南進行更新。

2 微陣列技術在基因組拷貝數變異中的應用

自從20世紀60年代晚期染色體顯帶技術問世以來,細胞遺傳學診斷檢查已經發生了顯著的變化。一些DNA相關技術,例如基因組拷貝數微陣列 \\(細胞遺傳學微陣列,即CMA\\),已經成為目前臨床應用的最新技術。比較基因組雜交最初是用來通過一次實驗進行全基因組不平衡重組的篩查。然而傳統意義上的比較基因組雜交只有3~10Mb的分辨率,與高分辨率核型分析區別不大,所以后來被微陣列技術加以利用。芯片比較基因組雜交技術是利用玻璃襯底來附著被克隆的細菌人工染色體\\(BACs\\)或被合成的如寡聚核酸\\(oligos\\)DNA片段,從而作為基因組在染色體上的精確定位。通過比較患者和標準DNA的雜交效率可得出拷貝數差異,單核苷酸多態性雜交芯片可用來檢測基因組拷貝數差異,也可以檢測拷貝數中立區的同源性。這種情況下,患者的DNA被標記并雜交到微陣列上,通過比較患者及某一已知DNA的雜交結果來得出結論。需要指出的是,并不是所有的基因組拷貝數變異都是病理現象,目前已知正 常 人 平 均 基 因 組 拷 貝 數 變 異 在800或 更多。

芯片的分辨率及產出取決于其對基因組的覆蓋率\\(探針的長度和間距\\),以及統計時設定的標準。微陣列技術相對于傳統細胞遺傳學分析具有更高的分辨率,為鑒別染色體異常提供了更加精確、敏感的技術。

3 臨床應用

Rauch等通過研究不明原因認知障礙患者的遺傳診斷,比較了不同遺傳學檢查的有效性。他們的研究表明,分子核型分析對新型染色體異常僅有不到0.6%的漏檢率。他們指出分子核型分析在認知障礙患者單測試診斷中確診率最高\\(28.9%\\),故作 者 提 議 此 檢 查 作 為 一 線 檢 測。近 日Miller等發表的一篇綜述討論將CMA作為發育遲緩/智力障礙\\(DD/ID\\)、多種并發先天畸形、自閉癥候群\\(ASD\\)的一線檢測手段。上述基于21 698例具有相關癥狀患者的研究表明,CMA作為一線檢測具有比傳 統G顯 帶 染 色 體 核 型 分 析 檢 測 手 段 高12.2%的 確 診 率。

Hochstenbach等通 過 評 估36 325例DD/ID患者得出結論,CMA適合作為此類患者的 一 線 檢 測。他 們 發 現 病 理 性 異 常 達 到19%。Shen等研究了CMA在自閉癥患兒診斷中的應用,并發現CMA適用于此類病患的一線檢測方案。他們發現核型分析以及脆性X染色體檢測的檢出率分別為2.23%和0.46%,而微陣列的檢出率為18.2%\\(n=848\\),其中7%為顯著異常。用CMA檢測到的新型拷貝數變異\\(CNVs\\)以及亞顯微缺失和復制,表現出與ASD的相關性,這些異常往往位于基因組中與自閉癥相關的基因位點。CMA還被應用到某些用傳統方法檢測為平衡易位但具有生理性或認知障礙的患者。CMA檢測顯示這些易位往往是不平衡易位,數個研究顯示大約有20%的個體,用傳統方法檢測顯示為新發或家族性平衡 易 位,但 用CMA檢 測 時 顯 示 為 非 平 衡 易位。近期研究表明CMA在其他醫學應用中也有顯著價值。

Adam等報道了3例發育遲緩或異形患者,通過CMA檢測發現了抑癌基因的微缺失。在另一個病例數更大的研究中,Adams等發現大約0.18%的患者具有腫瘤易感基因的缺失或獲得。2篇報道的作者都強調了CMA在這些檢測中的重要性,提示CMA除了能為發育遲緩/并發先天性畸形提供遺傳學解釋,也能為這些患者提供腫瘤易感性信息。微陣列分析不僅能檢測某些影響特定基因拷貝數的變異,也能辨別由于基因組斷裂被破壞的基因。

這種破壞可能是由于破壞編碼序列,也可能是由于影響到轉錄或翻譯效率。相關的例子如斷裂破壞了轉錄啟動子,也有例子表明NRXN1和CNTN4基因會被這種情況破壞。Moeschler等以及Saam等指出,正確的診斷能為臨床醫生提供機會明確治療方法、預后、復發幾率以及避免不必要的檢測。

4 檢測平臺

盡管微陣列分析能有效檢測染色體不平衡,最終能提高患者治療水平,臨床醫生在下醫囑前應了解不同的臨床檢測平臺特性 \\(例如選擇BAC還是oligo,選擇針對某組基因還是全基因組或單核苷酸多態性\\),以及不同平臺能提供的不同分辨率和信息量。例如,許多臨床醫生不了解全基因組寡聚核苷酸芯片技術能檢測到細菌人工染色體芯片技術不能檢測到的拷貝數變異,也不了解單核苷酸多態性芯片能檢測由于染色體同源引起的長片段同源性 \\(LCSH\\),2種異常都增加常染色體隱性風險。

芯片分辨率取決于探針的種類、數量以及探針在基因組的分布情況。細菌人工染色體探針比寡核苷酸探針\\(應用于寡核苷酸或單核苷酸多態性芯片\\)而言更長 \\(BACs為75 000~150 000個堿基,寡核苷酸多為50~60個堿基\\)。這個差異導致了BAC芯片對拷貝數變異檢測的特異性相對較低。

在寡核苷酸芯片中使用更高的探針密度能通過多個相連的探針評估拷貝數,增加檢測結果的準確性。寡核苷酸芯片相對于BAC芯片具有更高的可重復性和更少實驗間差異的特點。單核苷酸多態性\\(SNP\\)微陣列也能提供全基因組拷貝數分析。此外,SNP芯片能檢測例如片段性染色體 同 源 這 一 類 的 “拷 貝 數 中 立”異 常;此 類LCSH會引起病變、先天性畸形或認知障礙。SNP芯片正被越來越多地應用于認知障礙或發育遲緩伴或不伴有并發畸形的診斷。

在下CMA檢測醫囑時,臨床醫生需了解不同的檢測平臺和它們的局限性,需咨詢檢測實驗室芯片是否涵蓋目的區域\\(例如端粒,X染色體,常見微缺失區域\\)。臨床醫生還需了解發現異常結果后,何種后續檢測能被使用。另外,對于缺失或復制的情況,應進行對父、母親的檢測\\(FISH或有絲分裂中期染色體檢測\\)以甄別插入或遺傳性復制引起的染色體重組。此類家庭雖然存在幾率低,但復發率高達50%。隨著診斷檢測手段的增加,人們開始了解更多可能的以及過去未曾預料到的檢測結果。比較基因組雜交芯片以及我們現在了解的良性拷貝數變異就是這樣的例子。超過75間實驗室組成了一個國際協會來解答一些關于芯片檢測的問題。國際標準細胞基因組芯片協會\\(ISCA協會\\)致力于標準化和統一CGH檢測結果的匯報和分類,包括病理性和良性的,以便為臨床醫生提供最準確和最新的信息。目前有幾個數據庫可供參考基因位點及功能:拷貝數變異和最新的病變信息有加州大學圣塔科魯茲分校數據庫 、多倫多基因組變異數據庫,DECIPHER和ECARUCA。如前所述,決定使用CMA檢測的臨床醫生需了解CMA的改進及局限性。

CGH芯片不能檢測到易位、倒位平衡染色體重組或是鑒別染色體三體和羅伯遜平衡易位。如使用了不當的性別作為對照,一些非整倍性例如XYY會被漏檢。由于芯片涵蓋范圍、標志染色體組成情況以及標志染色體上特定染色體成分的差異,一些標志染色體也會被漏檢。有報道顯示此檢測可被應用于嵌合體,但因準確率較低而受到質疑。近期Scott等提示帶有多余染色體的嵌合體有10%能被檢出,帶有缺失或染色體片段重復的嵌合體能有20%~30%的檢出率。這些研究結果有待驗證。有時當親本樣品缺失或數據庫數據不全會影響到對某些罕見拷貝數變異的詮釋,且某些微陣列檢測不能檢出三倍體。

微陣列 技 術 檢 測 不 適 用 于 快 速 檢 測 \\(例 如STAT新生兒分析\\),尤其是疑似染色體三體的情況。目前一個STAT G顯帶染色體分析只需要48小時。應用CGH芯片,僅雜交一步就需要48小時。完成芯片檢測一般需要3~5天,分析、整合FISH結果\\(研發一個新探針需要幾周時間\\)、分析患者樣品以及最終得出結論則需要更長時間。

盡管微陣列是有力的診斷染色體拷貝數變異的工具,但該類檢測并不適用于所有的一線檢測。例如,傳統核型分析更適用于常見的疑似非整倍體\\(如21三體、18三體或性染色體非整倍性\\)。在診斷如Williams綜合征一類研究非常完全的綜合征,利用單探針FISH會更加經濟有效。CMA不應被用于家族性染色體重組無癥狀個體或多次流產個體。最后,CMA不能檢出低水平嵌合體或是多倍體。

5 推薦指南

5.1 在下列出生后個體評估中推薦使用細胞遺傳微陣列檢測\\(CMA\\)作為一線檢測手段:①不符合常見遺傳綜合征的多種畸形;②非綜合征型的發育遲緩/智力障礙;③自閉癥癥候群。

5.2 推薦使用CMA對于某些生長遲緩,言語發育遲緩或其他罕見癥狀的患兒進行進一步研究檢測,特別是前瞻性研究和后繼分析。

5.3 對于使用CMA檢測出的染色體不平衡重組,推薦有效的隨訪檢查,可以進行對患者及親本的細胞遺傳學/FISH檢查,臨床遺傳評估及咨詢服務。