類孟買血型是一種較為罕見的紅細胞血型，血型血清學主要表現為： 紅細胞 H 抗原部分缺失，血清中存在抗 H 抗體，常導致 ABO 血型鑒定的錯誤。

該血型表型患者如接受含 H 抗原的血液可引起嚴重的溶血性輸血反應，嚴重影響安全輸血。因此，類孟買血型的鑒定在臨床輸血中具有重要的臨床意義。與 H 抗原形成有關的編碼基因 FUT1 位于19q13. 3。FUT1 基因突變導致了 H 抗原合成障礙，產生類孟買血型表型。國內外基礎研究對 H 抗原缺失的分子遺傳學基礎已有較為深入的研究，結果顯示： H 抗原缺失頻率及 FUT1 基因突變分子基礎在不同人群的有所差異［1 －4］。因此，我們對本地區3 例血型鑒定確定為類孟買血型的個體進行了FUT1 基因的克隆和測序，探討本地區類孟買血型表型產生的分子遺傳學基礎。

一、材料和方法

1.研究對象

收集我院 3 例經血型血清學鑒定為類孟買血型表型的患者標本，其中男性 2 例，女性 1 例； 年齡分別為：

18 歲（ 個體 1） 、37 歲（ 個體 2） 、65 歲（ 個體 3） 。以正常 O 表型患者標本為正常對照血清學檢測試劑和方法正定型用單克隆抗 A、抗 B 、抗 H 試劑及反定型用試劑 A、B、O 細胞，均購自上海市血液生物醫藥有限公司產品。用常規方法進行 ABO 及 H 血型鑒定，同時進行凝集抑制試驗以檢測唾液中血型物質。

2. 樣本 DNA 提取

以全血 DNA 小量提取試劑盒 （ 美國 Omega 公司產品） 抽提 3 例類孟買血型患者及正常表型患者基因組 DNA，嚴格按照試劑說明書進行操作。

3.FUT1 DNA 擴增

PCＲ 引物參考文獻［5］由上海生工生物工程公司合成。引物序列： F: 5'-CATTTGCTAATTCGCCTTTC-CTC-3‘，Ｒ： 5'-CCTTCTCTCCAACTCTCCCAAC-3’，擴增片段長度： 1286 bp。擴增反應體系體積 50 μl，其中： 2 × 緩沖液 25 μl，樣本 DNA 2 μl，LA Taq 0. 5 μl（ 日本 TaKaＲa 公司產品） ，dNTP mix 1 μl，引物 F、Ｒ各 1 μl，滅菌雙蒸水 19. 5 μl。PCＲ 參數： 94℃預變性5 min; 然后94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 2 min，30 個循環，72℃延伸 5 min 后冷卻至 4℃。 PCＲ 擴增產物在 2% 低熔點瓊脂糖凝膠上 100 V 電泳 30 min，凝膠成像儀成像，提示擴增成功后，從凝膠上切取目的 DNA 片段，用 AXYGEN 凝膠純化試劑盒（ AXYGEN 公司產品） 純化回收 DNA 片段。

4. FUT1 基因測序

純化的 PCＲ 產物在 T4 DNA 連接酶作用下與 T 載體連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取 4 個陽性克隆，提取質粒，以質粒 DNA 為范本測序鑒定 FUT1基因突變。

二、結 果

1.紅細胞 ABO、H 血型鑒定

3 個研究個體在 ABO 常規血型鑒定中正定型均為：O 型，反定型也均為 O 型，但是 O 細胞均出現不同程度的凝集，同時自身對照均為陰性。進一步的血清學鑒定發現 3 個研究個體血清中均有抗 H 抗體，而紅細胞上 H 抗原缺失（ 表 1） 。

2.唾液中 ABH 血型物質測定

凝集抑制試驗證實 3 個研究個體均為分泌型，其中個體 1，2 唾液中均含有 A、H 物質，而個體 3 唾液中含有 B、H 物質（ 表 1） 。

3.PCＲ 產物瓊脂糖凝膠電泳分析

高保真 DNA 聚合酶擴增目的。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳成像，可見單一的特異性條帶，提示成功擴增 FUT1 基因編碼區全長。

4.FUT1 基因測序分析

高保真 PCＲ 擴增產物，經 TA 克隆、測序及序列比對分析發現，個體 1 的 1 條染色體上 FUT1 基因為 h1（ 547-552delAG） ，另 1 條染色體上為 h4（ 35C ＞ T） ，即 FUT1 基因型為 h1h4; 個體 2，3 的 2 條染色體上FUT1 基因均為 h1（ 547-552delAG） ，即 FUT1 基因型為 h1h1。

討 論

類孟買血型是一種罕見的紅細胞血型表型，其主要特征是紅細胞表面 H 抗原部分或完全缺失，而分泌液中存在 H 物質。H 抗原是 Hh 血型系統的唯一抗原，是 A、B 血型抗原形成的基礎。在正常情況下，FUT1 基因編碼的 α1，2 巖藻糖基轉移酶催化 L-巖藻糖連接到前體糖鏈上從而形成 H 抗原。因此，FUT1 基因的異常是形成類孟買血型的重要分子基礎。FUT1 基因位于 19q13. 3，全長 5380 bp，其中編碼序列長為 1095 bp，編碼 365 個氨基酸。目前已經發現的 FUT1 基因異常包括缺失、錯義突變和插入突變等，包含了 30 種不同的突變。眾多國內外研究已表明： H 抗原缺失頻率及 FUT1 基因突變分子基礎在不同人群的有所差異。目前，本地區已經報道的 FUT1 基 因 突 變 分 子 基 礎 僅 有 h1 （ 547-552delAG） 、h2 （ 880-882delTT） 、h3 （ 658 C ＞ T） 、h9（ 424 C ＞ T）［1 －6］。為了進一步揭示對本地區類孟買血型個體的 FUT1 基因突變類型，我們對 3 例血型鑒定確定為類孟買血型的個體進行了 FUT1 基因的克隆和測序及比對分析。

我們首先通過常規血型鑒定、抗體篩選等血清學及唾液血型物質檢測等方法，確定了 3 例類孟買血型個體。隨后，我們提取了 3 個個體的基因組DNA。通過高保真 PCＲ 擴增了 FUT1 DNA，經過 TA克隆及測序證實了 3 例類孟買血型個體中，個體 1的 1 條染色體上 FUT1 基因為 h1（ 547-552delAG） ，另 1 條染色體上為 h4（ 35C ＞ T） ，即 FUT1 基因型為h1h4; 個體 2，3 的 2 條染色體上 FUT1 基因均為 h1（ 547-552delAG） ，即 FUT1 基因型為 h1h1。本研究的結果進一步證實了池泉等［6］報道的本地區類孟買血型個體的主要流行基因（ h1 和 h2） 的結論。同時，我們也發現 h4 基因型同樣存在于本地區類孟買血型個體中。

關于 h4 基因型在類孟買血型形成中的作用，目前研究還存在爭議。許先國等［7］研究結果認為，h4基因型（ 35C ＞ T） 是一種基因多態性，而不是引起類孟買型的基因突變，但是不能完全解釋郭忠慧等［8］研究發現的 2 例 h4h4 純合子的類孟買血型個體。

我們研究的個體 3 FUT1 基因為 h1/h4，由于 FUT1基因的遺傳方式是常染色體隱性遺傳，因此我們認為，h4 基因型的存在導致類孟買個體3 另1 條染色體上 FUT1 無效表達，最終導致了個體 3 類孟買血型表型的形成。

總之，類孟買血型的分子基礎在不同人群存在著差異，并且尚有存在爭議的問題。因此，擴大樣本量，進一步挖掘類孟買血型個體的 FUT1 基因突變情況，將有利于我們理解類孟買血型表型形成的機制。

參 考 文 獻：

1 Daniels G. Human blood groups. Oxford: Blackwell Science Ltd，2002: 185 － 187.

2 李勇，馬學嚴。 實用血液免疫學。 北京： 科學出版社。 2006: 146 －155.

3 Cai XH，Jin S，Liu X，et al. Molecular genetic analysis for the para-Bombay blood group revealing two novel alleles in the FUT1 gene. Blood Transfus，2011; 9（ 4） : 466 － 468.

4 Storry JＲ，Johannesson JS，Poole J，et al. Identification of six newalleles at the FUT1 and FUT2 loci in ethnically diverse individualswith Bombay and Para-Bombay phenotypes. Transfusion，2006; 46（ 12） : 2149 －2155.

5 黃豪博，范麗萍，魏世金，等。 中國福建地區類孟買血型個體FUT1 基因突變研究。 中國實驗血液學雜志，2010; 18 （ 5） : 1338－ 1340.

6 池泉，張愛，任本春，等。 類孟買血型基因分析及 1 種 FUT1 新無效等位基因的發現。 中國輸血雜志，2012; 25（ 11） : 1152 －1155.

7 許先國，洪小珍，吳俊杰，等。 中國人群中 ɑ1，2 巖藻糖基轉移酶基因 C35T 變異的頻率研究。 中華醫學遺傳學雜志，2005; 22（ 6） : 657 －660.

8 郭忠慧，向東，朱自嚴，等。 中國類孟買型 FUT1 和 FUT2 基因研究。 中華醫學遺傳學雜志，2004; 21（ 5） : 417 －421.