硝酸甘油作為治療心絞痛的基本藥物之一廣泛用于臨床。研究發現硝酸甘油的舒血管作用通過釋放一氧化氮\\( NO\\) 所介導。乙醛脫氫酶 2\\( ALDH2\\)具有硝酸酯酶活性，對硝酸甘油轉化產生 NO 起了關鍵作用，而 ALDH2 基因 Glu504Lys 多態性，會導致ALDH2 硝酸酯酶活性顯著下降，使硝酸甘油無效概率明顯上升\\( 14．9% vs 42．4% \\)。文獻建議，AL-DH2 504Lys 等位基因攜帶患者慎用硝酸甘油。
ALDH2\\( 504Lys\\) 等位基因在歐美人群中攜帶率極低，但在中國人群中攜帶率較高，部分人群攜帶率高達 30%。因此，在中國人群中檢測 ALDH2\\( Glu504Lys\\) 基因多態性具有積極的現實意義。本文研究建立了 ALDH2\\( Glu504Lys\\) 基因多態性檢測方法，以滿足臨床檢測需求。
1 儀器和試劑
PCR 儀［Bioer TC-96 / G / H\\( b\\) ，杭州博日科技有限公司］; 離心機\\( 飛鴿 TGL-16GB 上海安亭科學儀器廠\\) ; 紫外分光光度計\\( onedrop1000，上海諾晶生物有限公司\\) ; 點樣儀\\( GSM417，Affymetrix\\) ; 生物芯片全自動雜交儀\\( BR-526，上海百傲科技股份有限公司\\) ;生物芯片識讀儀\\( BE-2．0，上海百傲科技股份有限公司\\) ; 基因芯片圖像分析軟件\\( Arraydoctor 2．0，上海百傲科技股份有限公司\\) ; 凝膠電泳儀 \\( PowerBC-600BC，上海博彩生物科技有限公司\\) ，凝膠成像系統\\( Bioshine Gelx 1520，上海鷗翔生物有限公司\\) 。
DNA 提取試劑盒\\( BST01051，上海百傲科技股份有限公司\\) ; 雜交顯色試劑盒\\( BST03021，上海百傲科技股份有限公司\\) ; 醛基修飾的載玻片\\( BSM03011，上海百傲科技股份有限公司\\) ; 應用 Primer Premier 5．0軟 件 設 計 一 對 引 物: 5 ＇ Biotin - AAGACTTT-GGGGCAATACAG 3＇，3＇ CTTCTCAGGCTTAAAAT GGG5＇; 質控寡核苷酸: 5＇Biotin -ACATCCTCTGGATGATGT-GAGACCATGCGGAGC CCCTCCACG 3 ＇，2 條檢測探針: 野生型5＇\\( T\\) 16 CAGGCATACA CTGAAGTGAAAA3＇，突 變 型 5 ＇\\( T \\) 16 GCAGGCATACACTAAAGTGAAAACT 3＇，1 條質控探針: 5 ＇ NH2-\\( T\\) 16 GGTCTCACATCATCCAGAGGATGT 3＇\\( 上海生工生物工程服務有限公司\\) ; Taq 酶，10 ×buffer［天根生化科技\\( 北京\\)有限公司］; dNTP\\( 上海生工生物工程服務有限公司\\) ; EDTA 抗凝外周靜脈血樣本\\( 上海市第一人民醫院贈送\\) ; 膽紅素\\( CAS#35-65-4，上海源葉生物有限公司\\) ; 膽固醇\\( CAS#57-88-5，99%，上海將來實業有限公司\\) ; 三酰甘油\\( CAS#538-24-9，上海將來實業有限公司\\) 。
2、 方法與結果
2． 1 臨床樣本
EDTA 抗凝外周靜脈血樣本\\( 上海市第一人民醫院、長征醫院、華東醫院\\) ，不分病種、檢測目的、性別、年齡，只要滿足雙向測序和芯片檢測對樣本量要求即可入選。
2． 2 樣本處理
對 EDTA 抗凝外周靜脈血樣樣本，用 DNA 純化試劑盒\\( 上海百傲科技股份有限公司\\) 提取全基因組DNA。DNA 濃度為 10 ～ 60 ng·μl－ 1，A260/A280 的比值在1．5 ～2．0。取已純化的 DNA 3．0 μl作為擴增模板，加入上游引物\\( 10 pmol·μl－ 1\\) 、下游引物\\( 3．3pmol·μl－ 1\\) 各1．0 μl，Taq 酶\\( 2．5 U·μl－ 1\\) 1．0 μl，10 × buffer 2． 5 μl，dNTP\\( 各2． 5 mmol·L－ 1\\) 2．5 μl，雙蒸水14 μl，反應總體積 25 μl。PCR 反應條件為:50℃ 5 min; 94℃ 5 min; 94℃ 25 s，60℃ 25 s，72℃ 30s，35 cycles; 72℃ 5 min; PCR 產物 4℃ 保存。
2． 3 ALDH2 基因芯片的制備
將探針用少量純水溶解制備高濃度溶液，分別用2 × 點樣緩沖液配制各探針的點樣液，將各點樣液按照要求依次加入到 384 孔板中。使用醛基修飾基片作為 ALDH2 基因多態性檢測芯片制造的固相支持物。采用 GSM-417 生物芯片點樣儀，根據設計的陣列圖1 的點陣排布，進行點樣。點樣后置于恒溫箱中固定，避光保存。點樣時，環境溫度在 18-26℃，相對濕度為45% ～65%。探針點樣濃度為:5 μmol·L－ 1。
將點好的芯片置于室溫過夜固定。
2． 4 雜交檢測
在 BaiO\ue4d2e-Hyb 全自動雜交儀按表 1 設置反應程序，按表要求用量分裝雜交顯色試劑盒各試劑。吸取150 μl 雜交液，分別加入包含上述兩個檢測位點的擴增產物各10 μL，混勻。并將各試劑放入指定位置內，運行程序，雜交顯色反應自動進行。雜交完成后，將芯片顯色區用蒸餾水輕微沖洗、烘干，將芯片放入BE-2． 0生物芯片識度儀中進行掃描，獲得的芯片雜交結果圖像，用基因芯片圖像分析軟件\\( Arraydoctor2． 0，上海百傲科技股份有限公司\\) 提取各點的信號強度，輸入基因判型的閾值，由軟件進行數據分析，輸出芯片檢測的基因型結果。
2． 5 ALDH2 顯色基因芯片性能評價
2． 5． 1 芯片檢測靈敏度 選取經測序驗證 ALDH2基因型為 Lys504Lys 的樣本，提取基因組 DNA，濃度調整為50 ng·μl－ 1，進行梯度稀釋。將每個稀釋度DNA 進行 PCR 擴增并與芯片雜交，以重復三次檢測判型結果均正確的最低 DNA 量為檢出限。經試驗確定檢出限為5 ng 基因組 DNA。
2． 5． 2 芯片檢測準確度 選取 3 種 ALDH2 基因型的濃度為50 ng·μl－ 1基因組 DNA，分別進行 PCR 擴增并與芯片雜交。結果 3 種基因型樣本檢測結果均正確。
2． 5． 3 芯片檢測特異性 取魚精 DNA 稀釋至接近于正常人基因組 DNA 抽提濃度\\( 20 ng·μl－ 1\\) 作為陰性對照進行 PCR 擴增并與芯片雜交。檢測結果為陰性。
2． 5． 4 芯片檢測重復性 選取 ALDH2 基因型為Lys504Lys 的濃度為 25 ng·μl－ 1基因組 DNA，進行PCR 擴增并與芯片雜交，每個樣本重復檢測 10 次。10 次檢測結果基因型均一致。
2． 6 ALDH2 顯色基因芯片干擾實驗
取2-8℃保存不超過5d 的三種 ALDH2 基因型別\\( ALDH2 Glu504Glu 編號: H1; ALDH2 Glu504Lys 編號: H2; ALDH2 Lys504Lys 編號: H3\\) 的 EDTA 抗凝外周全血樣本，每種樣本分成 5 份，1 份不加干擾物作為空白對照\\( 編號: 空\\) ，1 份加入3 000 mg·dl－ 1三酰甘油\\( 編號: G\\) ，1 份加入250 mg·dl－ 1膽固醇\\( 編號:Ch\\) ，1 份加入 20 mg·dl－ 1膽紅素\\( 編號: Bi\\) ，1 份完全溶血\\( 編號: He\\) 。按照血液基因組 DNA 提取方法提取上述樣本血液基因組 DNA，經 PCR 擴增并與芯片雜交檢測基因型，每種樣本重復 2 次，H3 基因型的樣本量較少，只操作1 次。
研究結果顯示，含有上述干擾物質的血樣，經DNA 提取后，DNA 的濃度和純度與正?？瞻籽獦酉啾?，沒有顯著差異，經 PCR 擴增及基因芯片雜交檢測，結果正常并與已知基因型一致。因此 EDTA 抗凝全血樣本中含有 3 000 mg·dl－ 1的三酰甘油，250 mg·dl－ 1的總膽固醇，20 mg·dl－ 1的膽紅素，對 ALDH2基因芯片測定沒有影響，完全溶血的 EDTA 抗凝全血對測定也沒有影響。
2． 7 ALDH2 顯色基因芯片精密度實驗
選擇3 種 ALDH2 基因型已知\\( 雙向測序\\) 的樣本，每個樣本分成三份，分別送三個參加臨床實驗的實驗室用申報試劑盒測定。每個實驗室采用三個批號的試劑盒，每個批號試劑對每個樣品由同一實驗室的三名檢驗員各測定三次。根據正確測定結果占總測定結果的百分率計算試劑盒產品的批內，批間精密度和差異。
精密度實驗共獲得243 個檢測結果。243 個檢測結果與已知基因型均符合。以定性結果評價，批內批間均無差異。
2． 8 ALDH2 顯色基因芯片方法比對實驗
將基因芯片檢測結果與雙向測序法檢測結果比較，評價 ALDH2 顯色基因芯片方法臨床適用性。選擇三家醫療機構實驗室，共獲得 1035 份來自臨床檢驗的 EDTA 抗凝血樣。將選取的臨床病人檢測樣本一分為二，一份直接送交選定的基因測序機構對樣本基因組 DNA 中 ALDH2 基因的 Glu504Lys 位點進行雙向測序; 一份進行芯片檢測。芯片檢測或測序不成功的樣本予以剔除。
方法比對研究數據見表2，共獲得1026 個基因芯片檢測結果和1012 份雙向測序結果。樣本存在 3 種ALDH2 基因型如圖 2 所示。經統計有 1009 份樣本基因芯片檢測結果和基因測序結果均完整，比對分析，有1007 份基因型檢測結果與測序結果完全一致，有2份樣本結果不一致，芯片檢測結果為 ALDH2\\( G/G\\)型，測序結果為\\( G/L\\) 型。經實驗分析，可能的原因是樣本 DNA 提取失敗，濃度低于檢出限所致。統計結果顯示，測試試劑盒臨床檢測的檢出率為: 99．13%\\( 1026/1035\\) ; 正確率為:99．80%\\( 1007/1009\\) 。
2． 9 ALDH2 顯色基因芯片穩定性實驗
取制備好的 ALDH2 基因芯片 24 片及配套的PCR 擴增及雜交顯色試劑，置于 － 20℃ 冰箱長期儲存，分別于0，1，3，6，12，18 個月取出3 片，用新鮮 ED-TA 抗凝血樣提取的濃度稀釋至 8 ng·μl－ 1的雜合DNA 進行 PCR 擴增并與芯片雜交，結果與新制備的ALDH2 基因芯片及配套的 PCR 擴增及雜交顯色試劑檢測結果比較。實驗結果見表3，ALDH2 顯色基因芯片及其配套試劑，在 －20℃儲存18 個月，檢測靈敏度沒有明顯變化，具有良好穩定性。
3、 討論
3． 1 芯片設計
臨檢用基因芯片的設計包括探針結構的設計; 質控探針的考慮; 探針濃度的選擇; 陣列排布的設計等。在探針結構設計上，為便于探針固定在醛基基片上，探針的5＇端進行氨基修飾; 為保證探針與擴增產物雜交反應的充分性，減小反應的空間位阻，在探針與氨基之間還可以包含一段 5 ～25 聚的聚脫氧胸苷酸。
質控探針的設置應當以達到質量控制目的為原則。
本研究基因芯片設置的質控探針可以同時起到陽性質控探針和化學修飾探針的作用。該探針與檢測探針一樣只進行了5＇氨基修飾，在基片上的固定效果可以反映探針修飾質量; 同時該探針只與反應體系中外加的帶有生物素標記的靶標\\( 質控寡核苷酸\\) 發生特異性雜交反應，該反應只與雜交過程相關，故可用于監控雜交過程的質量。鑒于芯片是用于人染色體基因檢測，可以不設置陰性對照探針和內對照探針。使用本芯片時，需用陽性對照品和陰性對照品建立嚴格反應條件，并定期重復上述實驗來控制芯片雜交的特異性。對于芯片陣列的設計，必須考慮有助于克服點樣誤差、實驗偏差、軟件自動分析結果時可能出現誤判的各種可能。通常將陽性對照探針按一定規則排布，便于軟件自動對陣列的定位、尋點、采集信號。每個探針點的重復次數最好不少于 3 次，取平均值可克服點樣誤差。本研究每個探針重復 6 次，交叉排列，除有利于克服點樣誤差，還可發現由于實驗偏差導致的信號不均勻分布導致的誤判。
3． 2 芯片性能評價
基因芯片檢測技術操作簡便、可快速、準確、高通量的分析數以千計的基因組信息，非常適合于常規臨床檢驗。評價基因芯片性能的方法和指標必須與實際應用相對應。臨床檢驗關心的性能指標主要包括: 準確性、靈敏性、特異性、重復性、抗干擾性、穩定性等。評價上述指標時，應當使用真實的臨床樣本，而不建議使用質粒。質粒比基因組小很多，比較純，試驗結果與真實樣本差異很大。在評價靈敏性時，宜選擇雜合型樣本。同等濃度下與純合子相比，雜合型樣本等位基因的拷貝數減半，對擴增的影響更大。評價重復性時，選擇中等濃度 DNA 更有代表性。
3． 3 測定結果分析
文獻報道，ALDH2 504Lys 等位基因在歐美人群中攜帶率極低，但在中國漢族人群中的攜帶率 17%～ 36% 不等。本研究檢測結果顯示上述等位基因攜帶率為22． 4%，與文獻報道一致。硝酸甘油作為心絞痛治療藥物，使用無效常常會產生嚴重后果。
而攜帶 ALDH2 504Lys 等位基因導致硝酸甘油無效概率大幅上升，因此在臨床開展基于 ALDH2 的硝酸甘油用藥指導符合醫療機構藥事管理規定對臨床藥師為臨床開展個體化用藥指導的要求。但大部分臨床藥學實驗室對遺傳分析檢測方法缺乏經驗，對自動化操作、結果準確、方法穩定可靠的基因檢測技術需求強烈。本研究建立的顯色基因芯片檢測方法，自動化程度高，操作簡便，結果準確，滿足臨床基因檢測需求，可以推廣。
