在 15 世紀至 18 世紀, 遠洋航行的水手們由于長時間得不到新鮮蔬菜水果的供給, 會出現牙齒松動、牙齦出血、肌肉酸痛無力以及皮下出血等癥狀, 嚴重的情況下會致人死亡, 這種疾病被命名為壞血病. 在人類幾百年來與壞血病對抗的過程中, 維生素 C 的存在逐漸被證明. 直到 1928 年, 生化學家 AlbertSzent-Gyorgyi 首次成功分離維生素 C. 之后, Szent-Gyorgyi 和化學家 Walter H. Haworth 通過對維生素 C性質及分子式的分析, 將維生素 C 重新命名為抗壞血酸\\(ascorbic acid\\). 根據手性的不同, 抗壞血酸分為 L-和 D-型\\(圖 1\\(a\\)\\), 維生素 C 為 L-抗壞血酸, 天然存在于生物體內的也為 L-抗壞血酸.
雖然維生素 C 對人類而言是必需的重要維生素之一, 但除了硬骨魚類、某些鳥類、靈長類、蝙蝠和豚鼠外, 大多數的脊椎動物具備自己合成維生素 C的能力. 人類無法合成維生素 C, 原因是人體合成維生素 C 最后一步的酶——古洛糖酸內酯氧化酶L-GulLO \\(L-gulonolactone oxidase\\)缺失. 在進化過程中, 維生素 C 的合成部位經歷了由腎臟到肝臟的轉變, 其中魚類、兩棲類、爬行類和一部分的鳥類是在腎臟完成維生素 C 的合成; 另外一部分的鳥類和哺乳類則是在肝臟中完成. 植物可以自己合成大量維生素 C, 這為許多動物提供了體內維生素 C 的來源;酵母也具有維生素 C 的合成能力, 但是酵母、植物和動物合成維生素 C 的途徑卻有所不同\\(圖 1\\(c\\)\\). 本文從介紹維生素 C 的生理功能開始, 重點聚焦近幾年來發現的維生素 C 對表觀遺傳層面的影響, 討論維生素 C 如何通過影響細胞的表觀遺傳修飾從而改變細胞命運.
1 、維生素 C 的生理功能
維生素 C 在動物體內有著重要的生理功能. 缺乏維生素 C 將導致壞血病, 其原因之一是體內膠原的合成和成熟受阻, 膠原由重復的結構 Gly-X-Y 組成, 其中 X 和 Y 代表脯氨酸\\(Pro\\)與 4-羥基脯氨酸\\(4-Hyp\\). 4-Hyp 是脯氨酸衍生物, 它的缺乏會導致膠原無法維持正常結構. 體內的脯氨酸羥化酶\\(prolyl-4-hydroxylase\\)需要維生素 C 存在的條件下才能正常發揮作用. 維生素 C 還在合成神經遞質以及肉毒堿的合成中起作用. 作為體內的重要抗氧化劑之一,它也參與許多低氧反應. 不同器官對維生素 C 的需求不同, 維生素 C 的吸收和利用主要由其受體輔助進行. 目前研究表明, SVCT1 \\(sodium coupled Vcco-transporters 1\\)和 SVCT2 是大鼠、小鼠以及人體中的維生素 C 受體, 其中 SVCT1 主要是上皮細胞吸收維生素 C 的受體; SVCT2 分布在神經元、內分泌系統以及骨組織等地方. 雖然大多數的哺乳動物能夠合成維生素 C, 但是受體的缺乏也會帶來重要的影響. Sotiria 等人的研究表明, Slc23a1\\(編碼 SVCT2的基因\\)缺失會導致新生小鼠立即死亡, 死亡的原因為呼吸系統衰竭以及腦部出血. Slc23a1–/–的小鼠具有合成維生素 C 的能力, 但由于受體的缺失, 無法在組織器官里正常富集, 因而表現出嚴重癥狀.
維生素 C 在動物體內的重要性, 從它依賴金屬離子以及a-酮戊二酸\\(α-ketoglutarate, 2OG\\)的雙加氧酶類\\(dioxygenases\\)的輔酶作用便可以窺見一斑, 前文提及的脯氨酸羥化酶便屬于該類酶. 在雙加氧酶的反應中, 維生素 C 是維持酶活必不可少的因素, 它負責電子傳遞, 及時將反應生成的 Fe4+還原形成 Fe2+,而其自身被氧化形成脫氫抗壞血酸\\(dehydroascorbate,DHA\\)\\(圖 2\\(a\\)\\). 這類酶中, 許多都是通過雙加氧的途徑完成去甲基化過程, 之中又有很大一部分和表觀遺傳調控直接相關, 如組蛋白賴氨酸去甲基化酶\\(lysine demethylases, KDMs\\)和 DNA 去甲基化酶\\(圖2\\(b\\)\\), 因此維生素 C 對于生命活動的影響可能有更加廣泛的生物學意義. 維生素 C 還是一種重要的細胞培養的添加成分, 在胚胎干細胞\\(embryonic stemcells, ESCs\\)的培養中, 一種代替血清的培養基 KOSR\\(knockout serum replacement\\)中, 含有較高的 L-抗壞血酸; 用添加了維生素 C 的培養基培養細胞, 細胞的DNA 去甲基化水平會提高. 在誘導體細胞重編程過程中添加維生素 C, 可以提高重編程效率, 并且可以提高得到的 iPSC 克隆質量.
2、 維生素 C 與組蛋白/DNA 去甲基化酶
前文提到維生素 C 會影響表觀遺傳修飾相關的組蛋白賴氨酸去甲基化酶和 DNA 去甲基化酶, 因而參與細胞的表觀遺傳調控過程, 這是維生素 C 值得注意的一個新功能. 在多細胞生物中, 同一套遺傳物質可以表現為多種表達模式或細胞類型, 這種調控一般是通過組蛋白、DNA 等遺傳物質上的共價修飾來實現的, 這種調控稱之為表觀遺傳調控, 是決定細胞功能的重要開關. 在這些修飾中, 組蛋白上賴氨酸殘基的甲基化及 DNA 胞嘧啶的 5 位甲基化, 扮演著重要的角色. 例如, 常見的組蛋白 H3 賴氨酸修飾有K4, K9 和 K27 等, 其中 H3K4me3 被作為轉錄激活的標志, H3K9me3 和 H3K27me3 則與基因表達沉默、X染色體失活等相關. DNA胞嘧啶5位的甲基化同樣在基因表達調控中起到重要作用, 如基因組 DNA 上存在一些區域, 富含胞嘧啶\\(C\\)和鳥嘌呤\\(G\\), 這段區域被稱為 CpG島\\(CpG islands\\), 哺乳動物基因的啟動子區域常常存在 CpG 島, 它們的胞嘧啶的甲基化程度往往與該基因表達的活躍程度成反比.
已知的組蛋白賴氨酸去甲基化酶可以分為依賴于黃素\\(flavin\\)的組蛋白去甲基化酶和依賴于 Fe2+和2OG、含有 Jumonji C \\(JmjC\\)結構域的雙加氧酶. 前一種酶主要包括 H3K4me1/2 和 H3K9me1/2 的去甲基化酶 LSD1 和 LSD2; 而后一種酶則包括了大多數的H3K4/9/27 的去甲基化酶, 這些酶不僅可以催化單甲基化和二甲基化, 三甲基化也可以作為它們的反應底物. 在催化反應過程中, 維生素 C 作為輔酶, 將Fe4+還原形成 Fe2+\\(圖 2\\). 含有 Jumonji 結構域的蛋白被分成了許多亞類, 不同的亞類具有不同的識別和催化位點. 一般來講, JmjC 結構域具有保守的 2 個組蛋白殘基和 1個谷氨酸殘基, 它們負責螯合金屬離子;具有 JmjC 結構域的蛋白通常含有其他的結構域, 如可以識別組蛋白修飾的 PHD, Tudor 結構域以及可以識別 DNA 的 ARID 和 CXXC 結構域, 這兩者相互配合, 不同的組蛋白去甲基化酶就展現出了各自的特性.
在對 DNA 胞嘧啶甲基化的探索中, 早期的研究表明DNMT家族的蛋白催化DNA胞嘧啶的甲基化反應, 而對于去甲基化過程的認識卻停留在通過 DNA復制引發的被動去甲基化. 2009 年, Tahiliani 等人通過對錐蟲中 JBP 蛋白的比較, 發現在哺乳動物中存在 TET1, TET2 和 TET3 三種同源蛋白\\(paralogousproteins\\), 這 3 種蛋白的結構類似, 都具有半胱氨酸富集區\\(Cys-rich\\)以及 DSBH 結構域, 是一類依賴于Fe2+和 2OG 的雙加氧酶. 它們可以將細胞中的 5-甲基胞嘧啶\\(5-methylcytosine, 5mC\\)氧化形成 5-羥甲基胞嘧啶\\(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC\\). 進一步的研究發現, TET \\(ten-eleven translocation\\)家族蛋白可以將 5hmC 繼續氧化形成 5-甲?；奏\(5-formylcy-tosine, 5fC\\) 和 5- 羧基胞嘧啶 \\(5-carboxylcytosine,5caC\\), 最后在糖基化酶 TDG \\(thymine DNA gly-cosylase\\)的作用下, 利用堿基切除修復\\(base-excisionrepair, BER\\)途徑完成 DNA 的主動去甲基化. TET蛋白介導的主動去甲基化在哺乳動物個體的繁殖和發育過程中有重要作用. Gu 等人的研究表明,TET3 參與到受精過程中精子的主動去甲基化 ;Hackett 等人的研究發現, 生殖細胞的去甲基化和印記基因的擦除是依賴于 TET1 與 TET2 產生的 5-羥甲基胞嘧啶. 此外, TET 家族蛋白在胚胎干細胞中的作用也得到研究人員的關注.
目前研究證明, 維生素 C 可以促進 TET 介導的5-甲基胞嘧啶的氧化. 在 Yin 等人的研究中, 通過提高維生素 C 的濃度, 可以促進 TET 體外以及細胞內的酶活, 增加 5hmC 和 5fC 的產生量; 該研究還證明了維生素 C 可以與 TET 的催化域結合. 在小鼠胚胎干細胞\\(mESCs\\)的培養過程中添加維生素 C, 同樣可以檢測到 5hmC 水平的升高, 但是 Tet1/Tet2–/–的mESCs 卻基本檢測不到 5hmC 的存在, 暗示 mESCs中 5mC 的去甲基化是由 TET1 和 TET2 完成, 而表達量較少的 TET3 可能對 mESCs 的影響較小. 早期Chung 等人對人胚胎干細胞\\(hESCs\\)的研究中發現,在培養過程中添加維生素 C, 會特異性的提高 1847種基因的去甲基化, 其中一部分基因 CpG 島的甲基化水平的降低導致基因表達的變化. 最近, Blaschke等人的研究發現, 維生素 C 可以影響小鼠胚胎干細胞中 TET 蛋白的活性, 提高 mESCs 基因組整體5hmC 水平 , 以及一些生殖系相關的基因如 Asz1,Dazl 等基因啟動子的 hmC 水平, 并促進這些基因的表達, 使胚胎干細胞表現出囊胚樣的狀態. 另外有研究報道, 維生素 C 可以通過促進 JAK/STAT2 信號通路中 STAT2 的磷酸化程度, 促進 Nanog 表達,維持胚胎干細胞的多能性網絡. 另一方面, 維生素 C還可以幫助胚胎干細胞抵抗 RA引起的分化, 以及L-Pro 引起的間充質樣細胞轉變的過程. 維生素 C對細胞的影響, 不僅僅表現在對胚胎干細胞上. Mi-nor 等人在小鼠胚胎成纖維\\(MEF\\)的培養過程中添加維生素 C, 也可以觀察到 5hmC 水平的提高. 由于MEF 中 TET1 與 TET2 表達量比較低, 這個羥甲基化的過程很有可能是由 TET3 介導的.
除了上面介紹的這2種酶, AlkB蛋白家族作為一種重要的依賴于 Fe2+和 2OG 的雙加氧酶, 在表觀遺傳調控中也有重要作用. AlkB 蛋白在細菌的DNA 損傷修復中發揮作用, 在人體內至少有 9 種AlkB 蛋白家族的成員 , 分別是 ALKBH1-8 \\(又名ABH1-8\\)和 FTO. 其中 E. coli 中的 AlkB 蛋白、人的ALKBH2 蛋白以及 TET2 蛋白的蛋白結構已知 .
AlkBH 家族可以參與到多種 DNA 以及 RNA 的修飾修復中, 如 1mA, 3mC, 1mG, 以及 3mT; FTO 是這個家族中有趣的成員, 據報道與人類的肥胖有關,而且除了可以參與 3mT 的修復外, 還是一種 RNAm6A 的去甲基化酶. 雖然目前維生素 C 對 AlkBH家族的影響尚未知曉, 但是從維生素 C 在雙加氧酶發揮酶活作用中舉足輕重的地位可以推測, 這將會是個重要的研究內容.
3、 維生素 C 與重編程
近年來, 維生素 C 在細胞重編程, 特別是誘導多能性干細胞\\(induced pluripotent stem cells, iPSCs\\)方面\\(圖 3\\), 給我們帶來了許多新的驚喜和疑問.
iPSCs 技術出現初期因誘導效率低 \\(~0.001%~0.0001%\\)和使用了原癌基因 c-Myc 而受到許多質疑,因此尋找更加安全、高效的誘導方式成為許多科學家研究的方向. 在眾多的提高 iPSCs 誘導效率的方法中,在誘導培養基中添加維生素 C 的方法嶄露頭角. 2010年, Esteban等人在研究中發現, 維生素C可以提高OCT4/SOX2/KLF4/c-Myc \\(OSKM\\)以及 OCT4/SOX2/KLF4 \\(OSK\\)的重編程效率. 維生素 C 起初被認為作為一種抗氧化劑而起到了促進重編程的效率, 但是其他的抗氧化劑如還原型谷胱甘肽、維生素 B1 和亞硒酸鈉等并沒有顯著促進重編程的效果, 表明維生素 C 對重編程的促進作用遠非是通過減少細胞 ROS起作用. 接下來的研究發現, 維生素 C 可以抑制重編程過程中 P53 和 P21 蛋白的表達, 從而幫助細胞繞過衰老的路障. Wang 等人之后的研究發現, 維生素 C可以影響組蛋白 H3K36me2/3 的去甲基化酶 Jhdm1a/1b. Jhdm1b 能夠抑制 Ink4/Arf 位點, 從而抑制細胞衰老并且促進細胞增殖; 另一方面, JHDM1b 通過與OCT4 的相互作用, 激活了參與干細胞多能性調控網絡的 mircoRNA 302/367 基因簇. 維生素 C 通過影響組蛋白去甲基化酶活性, 對重編程造成了影響.
另一方面, Stadtfeld 等人在研究 B 細胞重編程時發現, 誘導重編程培養基中加入維生素 C 可以防止印記基因位點Dlk1-Dio3印記的丟失. Dlk1-Dio3位點是位于小鼠第 12 條染色體的父本印記位點, 之前的研究表明, 該位點印記丟失的小鼠 iPS 細胞無法形成具有四倍體互補能力的“all-iPS”細胞. 維生素 C加入之后, 促進該位點的 IG-DMR 形成 H3K4me3,從而阻止了 Dnmt3a 對該位點的甲基化修飾, 保護了Meg3 \\(又名 Glt2\\)的正常表達.
在小鼠重編程的過程中, 會產生一種形態類似iPS 細胞, 但是內源多能調控網絡并未激活的細胞,這種細胞可以在外源基因沒有沉默的情況下進行自我更新, 并且可以穩定傳代建立細胞系, 這一類被阻滯在重編程道路上的細胞, 被稱為 pre-iPSCs.
Esteban 等人的研究發現, 維生素 C 可以促進pre-iPSCs 向 iPSCs 的轉變, 但是其作用機理并不清楚. 最近, Chen 等人的研究發現, 組蛋白 H3K9 的甲基化是造成 pre-iPSCs 形成的主要原因. 在重編程的誘導過程中, 血清中含有的骨形成蛋白家族\\(BMPs\\), 能夠作用于其下游的 H3K9 甲基轉移酶, 從而阻礙了重編程的進行; 另一方面, 如果在培養基中添加維生素 C, 則可以通過激活 KDM3/4 等 H3K9 的去甲基化酶來重新激發重編程過程. 雖然不同的pre-iPSCs 具有很大的異質性, 但是在培養過程中加入維生素 C, 對于激活 pre-iPSCs 中的多能調控網絡,將其重新引向重編程的道路是十分行之有效的方法.
綜上所述, 維生素 C 通過影響組蛋白的修飾, 從而影響重編程的過程讓我們對維生素 C 在細胞命運中所起到的作用有了全新的認識; 而最近在研究DNA 去甲基化酶 TET 蛋白在重編程過程中的作用,維生素 C 又為我們帶了戲劇性的一幕. 研究表明,TET1 和 TET2 能夠促進體細胞重編程, TET1 甚至可以取代 OCT4, 形成 TET1/SOX2/KLF4/C-MYC \\(TSKM\\)的 iPSCs. 然而, 當誘導培養基中添加了生理濃度的維生素 C\\(~76.5 μmol/L, 小鼠血漿濃度\\)之后, TET1 對重編程的作用由促進變成了抑制. 造成這種轉變的原因是由于 TET1 酶活的增強, 抑制了重編程早期的間充質-上皮轉化\\(MET\\)過程; 由于TET1 酶活增強而帶來的 TET1 催化位點是否發生了改變, 還有待進一步的研究.
4、 討論與展望
維生素 C 在維持生物個體健康與細胞正常培養狀態的機理具有多樣化, 它參與生化反應, 維持著代謝與調控之間的穩態, 特別是在表觀遺傳調控方面,如果這其中的平衡被打破, 生物體極有可能患代謝或是癌癥之類的疾病. 維生素 C 還是兒茶酚胺類物質合成不可缺少的物質, 多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素是體內重要的神經遞質和激素, 它們控制著人體的代謝以及情緒; 另一方面, TET 蛋白家族在神經系統中的高表達引發我們思考 DNA 主動去甲基化是否與記憶、認知的形成相關聯, 而維生素 C 直接與這些重要的生命現象相關, 更加體現了它對于生命體的重要性. 此外, 維生素 C 作為一種重要的抗氧化劑, 能夠清除體內產生的活性氧\\(ROS\\). 低氧壓力會誘導低氧誘導因子\\(HIF\\)的產生、提高 P53 的表達. 低氧條件是胚胎干細胞以及許多成體干細胞的生長環境, 對體細胞重編的影響也較為復雜. Yoshida 等人早期實驗表明, 采用 5%的低氧條件能夠提高小鼠以及人的 iPS 誘導效率; 最近研究發現低氧條件下產生的 HIF1α 與 HIF2α 在重編程的不同時期起到不同作用, 因此推測, 低氧條件下維生素 C 有可能通過間接影響了 HIF, ROS, P53 等與細胞代謝或是衰老相關的途徑影響體細胞的重編程.
在漫長的生物進化過程中, 包括人在內的一些動物對于維生素 C 合成能力喪失, 雖然其中原因目前尚未知曉, 但由于生存環境中富含維生素 C 食物的繁多, 并沒有被自然選擇所淘汰. 維生素 C 對人體健康的作用一度成為有爭議的話題, 維生素 C 被認為能夠預防感冒, 并且能提高機體的免疫力, 甚至能夠抵抗癌癥的發生. 雖然這些觀點的正確性以及其背后的作用機理有待研究, 但是這個神奇的小分子足以給我們帶來許多健康和驚喜.
