γ-谷氨?；然?\\(γ-glutamyl carboxylase,GGCX\\)是維生素K循環中的關鍵酶,其功能是催化凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的γ-羧基化作用,其作用的發揮依賴于維生素K和O2。當還原型維生素K和O2存在時,GGCX將CO2摻入特異的谷氨酸殘基中,反應產生γ-羧基化的谷氨酸;同時產生維生素K 2,3-環氧化物。近期的國內外研究表明,GGCX是影響口服抗凝藥華法林用量個體差異的遺傳因素之一,其中研究較多的有GGCX\\(rs12714145\\)、GGCX\\(1181T→G\\)及GGCX 3261G>A位點的多態性與華法林用量個體差異的相關性。為了解GGCX的2個單核苷酸位點\\(rs11676382和rs6751560\\)基因多態性在新疆地區哈薩克族、漢族人群中的分布情況,本研究應用多聚酶鏈反應-限制性內切酶長度片段多態性 \\(PCR-RFL P\\)技術對新疆醫科大學第一附屬醫院305例哈薩克族和305例漢族健康體檢者GGCX的2個單核苷酸位點基因型進行檢測,計算基因分布頻率,并進行分析和比較。

1、資料與方法

1.1一般資料

隨機選取2011年1月-2012年12月在新疆醫科大學第一附屬醫院進行健康體檢的哈薩克族和漢族人群各305例,其中哈薩克族男性147例,女性158例;漢族男性150例,女性155例,年齡18~80歲。

1.2方法

1.2.1樣本采集與DNA提取

抽取受檢者外周靜脈血5mL,EDTA-Na2抗凝。標準酚-氯仿法提取基因組DNA,核酸蛋白分析儀\\(Eppendorf Bio-pho-tometer\\)檢測樣本DNA純度和濃度后 于-20℃保存備用。

1.2.2 PCR擴增

設計一對引物擴增包含GGCXrs11676382、rs6751560位點的片段\\(表1\\)。引物由生工生物工程\\(上海\\)有限公司合成。PCR擴增在C1000TMThermal CyclerPCR儀上進行,20μL PCR反應體系含:PCR Master mix\\(2X\\)10μL,上、下游引物各0.5pmol,ddH2O 7.5μL,基因組DNA 2μL。循環參數:95℃預變性3min,95℃變性30s,60.8℃\\(rs11676382\\)、59.0℃\\(rs6751560\\)退火30s,72℃延伸1min,共35個循環;最后72℃總延伸5min。PCR反應結束后,取10μL擴增產物在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳,觀察PCR產物的特異性和片斷大小。

1.2.3酶切分型

采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性\\(PCR-restriction fragment length poly-morphism,PCR-RFLP\\)的方法。\\(1\\)Hind Ⅲ內切酶用于消化rs11676382位點的擴增產物:取10μLPCR擴增產物 ,10×buffer R 2μL,Hind Ⅲ1μL,ddH2O 7.5μL,37℃下水浴過夜。\\(2\\)BsrI內切酶用于消化rs6751560的擴增產物:取10μL PCR擴增產物,10×buffer B 2μL,ddH2O 7.5μL,BsrI 1μL,65℃下水浴過夜。\\(3\\)2%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產物:取10μL酶切產物加入2%瓊脂糖凝膠負極端的加樣孔,以6×DNA Loading Buffer\\(Bro-mophenol Blue\\)為染色劑,在120V電壓下電泳25min,100V電壓下電泳10min,80V電壓下電泳15min,在紫外線燈下觀察帶型。

1.3統計學處理

采用基因計數法計算GGCXrs11676382、rs6751560基因型及等位基因頻率。采用SPSS18.0統計軟件對數據進行處理。不同民族人群基因分布情況的比較用χ2檢驗。所有數據用χ2檢驗判斷GGCX的等位基因頻率和基因型頻分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。以P<0.05為差異有統計學意義。

2、結果

2.1基因型檢測

經PCR擴增后GGCXrs11676382位點基因目的片段大小為283 bp,rs6751560位點基因目的片段大小為304bp。根據酶切情況,rs11676382位點基因型有3種:野生型CC有167bp和116bp 2個條帶,雜合型CG有167bp、116bp和283bp 3個條帶,突變型GG有283bp 1個條帶\\(圖1及圖3\\);rs6751560位點基因型有3種:野生型AA有304bp 1個條帶,雜合型AG有61bp、103bp、140bp和304bp 4個條帶,突變型GG有61bp、103bp和140bp 3條帶\\(圖2及圖4\\)。

2.2 GGCX rs11676382、rs6751560位點等位基因

和基因型分布rs11676382基因型CC、CG和GG在哈薩克族人群中分別有66例\\(21.64%\\)、233例\\(76.39%\\)和6例\\(1.97%\\),C和G等位基因的頻率分別為59.84%和83.50%;在漢族人群中分別有209例\\(68.30%\\)、93例\\(30.39%\\)和4例\\(1.31%\\),C和G等位基因的頻率分別為40.16%和16.50%。

rs6751560基因型AA、AG和GG在哈薩克族人群中分別有2例\\(0.66%\\)、11例\\(3.61%\\)和292例\\(95.74%\\),A和G等位基因的頻率分別為2.46%和97.54%;在漢族人群中AA、AG和GG分別有4例\\(1.31%\\)、3例\\(0.98%\\)和298例\\(97.70%\\),A和G等位基因的頻率分別為1.80%和98.20%\\(表2\\)。

2.3不同民族GGCX rs11676382、rs6751560位點基因多態性分布情況的比較

新疆地區哈薩克族與漢族人群rs11676382位點基因型比較差異有統計學意義\\(總χ2=134.9,P <0.01\\),顯性模型CC與CG+GG、隱性模型GG與CC+CG、附加模型CG與CC+GG之間比較顯示,顯性模型和附加模型比較差異有統計學意義\\(χ2=134.4和129.9,P <0.01\\),等位基因C與G比較差異有統計學意義\\(χ2=84.3,P <0.01\\)。rs11676382位點隱性模型比較差異無統計學意義。新疆地區哈薩克族與漢族rs6751560位點基因型比較差異無統計學意義\\(χ2=5.30,P>0.05\\),等位基因A與G比較差異無統計學意義\\(χ2=0.63,P >0.05\\),見表2。

3、討論

基因有遺傳效應的DNA片段是控制生物性狀的基本遺傳單位?；蛴?個特點:\\(1\\)能忠實地復制自己,以保持生物的基本特征;\\(2\\)基因能夠“突變”,突變絕大多數會導致疾病,另外的一小部分是非致病突變?；蛐陀址Q遺傳型,某一生物個體全部基因組合的總稱。等位基因\\(allele又稱作allelo-morph\\)一般指位于一對同源染色體的相同位置上控制著相對性狀的一對基因。等位基因頻率是群體遺傳學的術語,用來顯示一個種群中基因的多樣性,或者說是基因庫的豐富程度。

目前國內外有關基因多態性與某種疾病相關性、基因型對臨床上某種藥物需求量的影響等研究較多,其結果對臨床醫師在臨床上對疾病的治療及個體化用藥起到了不可忽視的作用,如華法林\\(Warfarin\\)是目前在臨床上常用的抗凝藥,用于瓣膜病、瓣膜置換、非瓣膜病性房顫、電復律、冠心病、肺栓塞和深靜脈血栓形成等的抗凝治療。但華法林用量存在個體差異,若劑量大,有嚴重出血的危險。諸多國內外研究顯示除了遺傳、環境、藥物、疾病等因素外,基因多態性在華法林個體用藥方面起一定的作用。

研究某個群或多個群基因多態性,且進一步行基因多態性與臨床藥物劑量需求的相關性研究,對臨床醫師在臨床上個體化用藥有很大的幫助。本研究結果顯示,新疆地區哈薩克族與漢族人群rs11676382位點多態性均以CC和CG基因型比較常見,C等位基因出現的頻率比G等位基因出現的頻率高;CC基因型是保護因素,而CG基因型是危險因素,GG基因型既不是保護因素,又不是危險因素。

rs6751560位點顯示:2個民族人群中GG基因型常見,A和G等位基因出現的頻率相等。本研究利用PCR-RFLP技術,對新疆哈薩克族和漢族人 群γ-谷氨?；然傅膔s11676382和rs6751560SNP位點初步進行了檢測分析,發現其不同的基因型及基因型分布頻率有差異,將來需要進行更多的相關性研究,使其為臨床及患者服務。