糖尿病性視網膜?。╠iabetic retinopathy,DR）是糖尿病性微血管病變中最常見的并發癥，也是糖尿病最嚴重的并發癥之一。糖尿病視網膜病變的病因復雜，至今發病機制不明。糖尿病視網膜病變主要以氧化作用造成視網膜的損傷，8-羥脫氧鳥苷（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHdG） 可以標記氧化應激損傷，通過免疫組化法可以檢測出 8-OHdG 的表達。研究[1]顯示，腎素血管緊張素系統（rennin-angiotensin system,RAS）的激活是 DR 發生發展的風險因素，阻斷 RAS 系統可以抑制糖尿病視網膜病變的發展。慢性高血糖可以激活 RAS 在眼內發揮作用從而導致 DR 的進一步發展。血管緊張素Ⅱ是RAS 的主要效應分子，其通過收縮血管的作用強效升高全身和局部血壓，研究[2]顯示血管緊張素Ⅱ受體（angiotensin Ⅱreceptors2,AT2R）也存在于視網膜及其他眼內組織。腎素原受體[（pro）rennin re-ceptor,PRR]為 RAS 系統成員之一。細胞外調節蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）分為 ERK1 和 ERK2,統稱為 ERK1/2,被激活后進入細胞核促進某些基因的轉錄和表達，與細胞的增殖分化有關。CD14 和 8-OHdG 免疫組化染色了解新生血管的產生和視網膜神經細胞的凋亡的情況，該實驗旨在通過觀察不同病程糖尿病視網膜病變大鼠視網 膜 中 AT2R 的 含 量 以 及 ERK1/2、磷 酸 化ERK1 /2（p-ERK1 /2） 蛋白的表達及 CD14、8-OHdG的表達，了解 RAS 系統在糖尿病視網膜病變中的作用。
1 材料與方法
1. 1 實驗動物 健康雄性 SD 大鼠 50 只，普通級，2 月齡，190 ± 20 g,由安徽醫科大學實驗動物中心提供，隨機分為正常組（10 只）和糖尿病組（38 只）。實驗期間各組大鼠均自由飲水和進食（普通飼料喂養）。
1. 2 主要試劑及儀器 鏈脲佐菌素（ streptozocin,STZ）購自美國 Sigma 公司；ERK1/2 單抗和兔抗磷酸化 ERK1/2 多抗購自美國 Santa Cruz 公司；TR-Izol、MMLV 購自美國 Gibco BRL 公司；內參 β-actin單抗購自武漢博士德公司；ECL 化學發光試劑盒購自美國 Pierce 公司。
1. 3 糖尿病大鼠模型建立 適應性飼養 1 周，1 周后將（200 ±20） g 的 48 只大鼠作為研究對象，血糖檢測均正常。依據文獻[3],大鼠一次性單劑量腹腔注射 STZ 50 mg/kg 溶于檸檬酸鹽緩沖液中（臨用前以1 ∶ 1 混合檸檬酸與檸檬酸鈉，pH 4. 5），對照組給予等劑量檸檬酸鹽緩沖液；48 h 后采用羅氏血糖儀測定尾靜脈血糖，血糖≥16. 9 mmol/L 認為糖尿病模型建立成功。模型建立后觀察 1 周后測量血糖，將血糖穩定在 16. 9 mmol/L 以上作為糖尿病組，此時開始計算糖尿病鼠病程。
1. 4 樣本制備 于病程 4、8、12 周分別處死大鼠，對照組各 3 只及糖尿病組各 7 只，10% 水合氯醛麻醉，5 ml/kg,放血處死，取其雙眼，快速在顯微鏡下冰上分離視網膜組織，EP 管凍存于 -80 ℃，2 只眼分開保存。
1. 5 免疫組化染色 使用免疫組化三步法：石蠟切片脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育 5 ~10 min 以消除內源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS 浸泡2 次，每次 5 min.5% ~ 10% 正常山羊血清（ PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 min,傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37 ℃孵育 1 ~ 2 h 或 4 ℃ 過夜。PBS沖洗3 次，每次3 min.滴加適量生物素標記二抗工作液，37 ℃ 孵育 30 min.PBS 沖洗 3 次，每次 5min.滴加適量的辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃ 孵育 30 min.PBS 沖洗，3 次每次 5 min.DBA稀釋 50 倍顯色 10 min,自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、封片。采用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，Image Pro Plus 6. 0 軟件分析圖像，以上切片每組隨機抽取 10 張切片進行光密度分析，記錄每張片子的光密度（optical density,OD）值。
1. 6 檢測 AT2R 受體 mRNA 表達 由基因庫查得大鼠 AT2R 的 mRNA 核苷酸序列，取視網膜組織100 mg,加液氮研碎后，用 TRIzol 提取總 RNA.實驗組和對照組分別取1 μg 總 RNA 以 MMLV 為逆轉錄酶作逆轉錄反應。cDNA 產物保存于 -20 ℃。優化擴增條件，使 PCR 擴增在對數期內進行。在 DNA擴增儀上進行 AT2R 的 PCR 擴增30 個循環。AT2R的退火溫度為 62 ℃。取 PCR 擴增產物 5 μl 在1. 5% 瓊脂糖中電泳，Imagemaster VDS 成像系統攝影存盤后應用計算機圖像分析軟件（TotallabV 1.01）行灰度掃描分析。以目的基因與 β-actin 的 PCR產物條帶灰度體積之比作為反映目的基因 mRNA水平的相對指標。
1. 7 ERK 信號通路檢測 配 10% 的 Tris-甘氨酸SDS 聚丙烯酰胺膠，膠放入電泳槽，槽中加滿 Tris-甘氨酸，樣品孔中加樣，電壓積層膠 8 V/cm（40 ~ 60V），分離膠 18 V/cm（100 V），當溴酚藍到底部停止，取出膠板，把分離膠放入轉移緩沖液中平衡 10min,裁取適當大小的硝酸纖維素膜，放入轉移緩沖液平衡 10 min.轉膜，電壓 110 V,1. 5 h;放入 5%脫脂奶粉的 TBS 封閉液中平衡 2. 5 h;滴加一抗，在室溫下翻轉搖床上作用 2 h,4 ℃過夜；TBST 漂洗 3次，每次 15 min,滴加二抗，室溫下翻轉搖床上作用1 h;TBST 漂洗 3 次，每次 15 min;ECL 熒光顯影液反應、曝光、顯影和定影。β-action 為內參照，計算待測蛋白條帶積分吸光度（integrated absorbance,IA）與β-action 的比值，表示待測蛋白的相對表達水平。
1. 8 統計學處理 采用 SPSS 17. 0 軟件進行分析，數據以 x珋 ± s 表示；兩組數據比較用 t 檢驗，相關指標采用多元線性回歸分析。
2 結果
2. 1 兩組大鼠的血糖水平及比較 結果顯示，糖尿病組的大鼠的血糖水平自第 4 周開始明顯高于對照組，差異有統計學意義（P <0. 01）。見表 1.
2. 1 糖尿病大鼠的視網膜神經細胞的凋亡及新生血管的情況 通過凋亡染色，高倍視野下進行光密度分析，結果顯示與對照組相比，4 周、8 周及 12 周病程的糖尿病組大鼠視網膜組織中 8-OHdG 的表達隨著病程延長增加[（0. 182 7 ±0. 025） vs （0. 198 7± 0. 021）vs（0. 242 5 ± 0. 314）vs（0. 252 0 ±0. 028）],各組 CD14 染色未見明顯新生血管的出現，各組 CD14 染色差異無統計學意義。見圖 1.
2. 2 RAS 系統關鍵分子 PRR 和 AT2R 表達水平4 周、8 周和 12 周糖尿病大鼠視網膜組織中 PRR及 AT2R 含量明顯比正常大鼠高，差異有統計學意義（P < 0. 05）；進一步進行組間比較，結果顯示，12周病程大鼠 PRR 及 AT2R mRNA 水平比 8 周病程大鼠顯著升高，8 周病程大鼠 PRR 及 AT2R mRNA水平較 4 周病程大鼠有明顯升高且組間差異有統計學意義 （P <0. 05）。見圖 2.
2. 3 PRR 及 AT2R 與視網膜神經細胞凋亡的關系進一步分析 AT2R 與 PRR 的表達水平與 8-OHdG水平是否存在一定的關系。通過多元線性回歸分析顯示，隨著病程時間的延長AT2R 及PRR 的表達水平與細胞凋亡水平均呈正相關性（P <0. 05）。見表2.
2. 4 Western blot 分析結果 糖尿病組 p-ERK1 /2的表達水平明顯比對照組高，并且隨病程的延長糖尿病組 p-ERK1/2 的表達水平、磷酸化水平升高。見圖 3.
3 討論
糖尿病是一種由多種原因引起糖代謝紊亂的終身性內分泌疾病，目前世界范圍內糖尿病患者人數約 2. 4 億，估計到 2025 年將達到 3. 5 億[4].隨著糖尿病護理水平的提高，糖尿病視網膜病變的發展和流行有所下降[5].有統計學研究[6]顯示糖尿病病程和血壓是影響糖尿病視網膜病變發生發展的重要因素。早期研究[7]顯示糖尿病視網膜病變患者血漿中腎素原會在發展為增殖性糖尿病視網膜病變時明顯增高，血漿腎素原水平可能是糖尿病微血管并發癥的敏感指標。Wagner et al[8]用反轉錄多聚酶鏈反應技術檢測發現腎素 mRNA 陽性表達的組織中，血管緊張素原及血管緊張素轉化酶兩種基因也呈陽性表達，進一步從基因水平證實眼組織有獨立合成 RAS 的能力。
糖尿病時，視網膜 RAS 活性增強，血管緊張素Ⅱ參與內皮細胞功能的紊亂，使得血管內皮細胞上形成單細胞層，同時促進內皮細胞與白細胞的結合反應，并增加局部分泌細胞因子如組織壞死因子等，這些均可導致血管內皮功能紊亂、血管痙攣、血栓形成、視網膜組織缺血低氧、新生血管形成、出現增殖性病變。抑制 RAS 系統可以控制糖尿病視網膜病變的發展[9 - 10].
研究[11]顯示，糖尿病黃斑水腫患者伴有或不伴有玻璃體后脫離者玻璃體液中血管緊張素Ⅱ濃度比非糖尿病患者及不伴有視網膜病變的糖尿病患者明顯升高，提示 RAS 系統在糖尿病視網膜病變發生發展中起到一定作用。
Park et al[12]指出氧化應激增強會導致糖尿病血管病變，8-OHdG 的水平標志了體內氧化應激導致的 DNA 損傷。Pan et al[13]以血清 8-OHdG 為評價氧化應激的指標探測糖尿病視網膜病變的氧化應激指標，得出糖尿病視網膜病變組比正常組顯著增高。血清氧化應激產物 8-OHdG 增加將預測糖尿病性視網膜病變的結論。本實驗利用免疫組化法檢測不同病程階段大鼠視網膜的凋亡因子 8-OHdG,發現隨著病程的發展，視網膜神經細胞 8-OHdG 表達逐漸增多，且明顯高于對照組，繼而可以得出隨著病程的發展，糖尿病視網膜病變大鼠視網膜細胞凋亡數量越多。
RAS 的生理作用主要通過血管緊張素 Ⅱ 與其受體（AT1R 和 AT2R）的結合來實現，利用 RT-PCR法檢測糖尿病大鼠視網膜 PRR 及 AT2R mRNA 的表達，了解不同病程糖尿病大鼠和正常大鼠 RAS 系統的表達水平以及變化趨勢。結果顯示 4 周、8 周和 12 周糖尿病大鼠視網膜組織中 PRR 及 AT2R 含量明顯比正常大鼠高。說明在發病后糖尿病大鼠視網膜組織中 RAS 系統被明顯激活，并且隨著病程的發展 RAS 系統作用增強。PRR 及 AT2R 的表達也隨著病程的發展逐漸增多，通過統計學分析顯示 8-OHdG 的表達與 PRR 及 AT2R 的表達有一定相關性，由此可以得出在糖尿病視網膜病變中 RAS 系統與細胞凋亡有相關性，同時也進一步證實了 RAS 與糖尿病視網膜病變的發展相關。
利用 Western blot 法檢測不同病程糖尿病大鼠和正常大鼠視網膜中 ERK1/2 和 p-ERK1/2 的表達，了解到 ERK 信號通路在糖尿病視網膜病變中被激活，并且在隨著病情的發展 ERK 信號通路活性增強。提示糖尿病視網膜病變 RAS 系統的激活與ERK 信號通路有關。
由于 CD14 可以標記新生血管的產生，本實驗中通過免疫組化法檢測各病程中 CD14 的表達，各階段病程中對照組及實驗組未見明顯 CD14 分子表達，顯示無明顯新生血管生成。糖尿病視網膜病變實驗病程中均未發現新生血管，可能與實驗設計有關，本實驗大鼠糖尿病視網膜病變病程較局限，并未包含糖尿病視網膜病變的全部病程。
本研究顯示糖尿病視網膜病變的發生發展與RAS 系統的激活有一定相關性，而 RAS 系統對組織的作用可能與 ERK 信號通路的激活相關，RAS 系統對新生血管生成的作用還有待進一步研究。
參考文獻
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[2] Kida T,Ikeda T,Nishimura M,et al. Renin-angiotensin system inproliferative diabetic retinopathy and its gene expression in cul-tured human müller cells[J]. Jpn J Ophthalmol,2003,47（1）：36- 41.
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