視網膜是由大腦向外延伸的視覺神經末梢組織，其結構復雜、精細、脆弱而代謝旺盛。其血管屬于終末血管系統，任何病理性的破壞和血管梗阻等引起的組織缺氧，均能導致組織壞死，使其喪失感受和傳導光刺激的功能。因此血管改變是視網膜病變的重要特點。視網膜血管鋪片是研究視網膜血管病變的重要技術。但這項技術的消化時間不宜掌握，展片難度大，很難制備出理想的視網膜血管鋪片。國內外學者多采用胰蛋白酶直接消化或胃蛋白酶 - 胰蛋白酶聯合消化制備視網膜血管鋪片。在本研究中，我們總結前人經驗，不斷摸索改進，建立了新的視網膜血管鋪片技術，現總結如下。
1 材料和方法
1. 1 材料
BALB / c 小鼠來源于軍事醫學科學院實驗動物中心【SCXK（ 軍） 2012 -0004】，SD 大鼠購自中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究中心【SCXK（ 京） 2012 -0001】，SYXK（ 京） 2013 -0019.犬購自北京日新科技有限公司【SCXK（ 京） 2011 - 0007】，恒河猴由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所提供【SCXK （ 京） 2014 - 0011】，SYXK （ 京） 2010 -0030.蘇木素及伊紅 Y 染色液均為國產試劑（ 益利精 細 ） ,高 碘 酸 （ 批 號 011108,北 京 ） ,Schiff（ UFG0108,上海） ,Proteinase K （ CALBIOCHEM,cat # 539480 ） ,Trypsin 1: 250 Porcine Pancreas（ AMRESCO,lot #2861C173） ,anti-CD31 antibody（ ABCAM,ab28364） ,anti-VEGF antibody（ BOSTER,cat#BA0407 ） ,兔 超敏二步法免疫組化檢測試劑（ 中杉金橋，PV - 9001） .正常羊血清工作液（ 中杉金橋，ZLI - 9056） ,抗體稀釋液（ 中杉金橋，ZLI -9030） .
1. 2 方法
1. 2. 1 大鼠視網膜血管鋪片的制備
大鼠脫頸椎法處死，摘取眼球，固定于 10% 中性福爾馬林。
沿距齒緣剪開眼球去除晶狀體，用蒸餾水漂洗，以視神經乳頭為中心將眼球壁均勻地剪成 4 份，剝離眼球壁視網膜層，再用蒸餾水漂洗。
將剝離出的視網膜放在蒸餾水中 37℃孵育 1 ~2 h,蒸餾水漂洗，孵育后的視網膜放入 1 g / L 的蛋白酶 K 中，56℃消化 13 ~17min,去除消化掉的感光層細胞，蒸餾水漂洗，再將視網膜層放入 3% 胰蛋白酶消化液中，37℃消化 40 ~60 min.
用吸管將半透明狀的血管網移入蒸餾水中漂洗，用吸管輕輕吹打非透明狀區域，直到血管網成透明狀，再將吹打成透明狀的血管網鋪到含多聚賴氨酸的載玻片上，展平，自然干燥。
在消化過程中，蛋白酶 k 消化時，每 5 min 輕柔搖動一次，再以最低完成消化時間為觀察起點： 蛋白酶 K 消化 13 min 時，肉眼觀察，輕柔搖動，若見感光層細胞脫落，即完成第一步消化。若消化不完全，每 2 min 輕柔搖動觀察一次，直至感光層脫落。
胰蛋白酶消化時，每 10 min 輕柔搖動一次，也是以最低完成消化時間為觀察起點，若消化不完全，每5min 輕柔搖動觀察一次。
1. 2. 2 不同動物的視網膜在消化酶中的消化時間
在大鼠鋪片基礎上，我們摸索了 BALB/c 小鼠，犬和恒河猴視網膜血管鋪片的消化時間表 1.
BALB / c 小鼠眼球小，在剝取視網膜層之前，要將眼球壁均勻剪成 2 份。犬和恒河猴眼球較大，結構特殊，取材后需立即固定 4h,再用鋒利的刀片在眼球的上下部各切開一個小口，繼續固定 24h.將眼球壁均勻地剪成若干等份，每一等份大小約 0. 4 cm ×0. 4 cm,再剝離視網膜層。
1. 2. 3 視網膜血管鋪片 HE 染色
將視網膜血管鋪片置于自來水中水化 15 min,蘇木蘇染核 1 min,自來水沖洗，伊紅復染 2 min,梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。
1. 2. 4 視網膜血管鋪片 PAS 染色
PAS 染色方法參照文獻[1]: 將視網膜血管鋪片置于自來水中水化 15 min,蒸餾水洗 2 次，加入高碘酸氧化 10 min,蒸餾水速洗 2 次，加入 schiff 試劑反應5 min,自來水流水沖洗2 min,蘇木素染核2 min,自來水返藍5 min,梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。
1. 2. 5 視網膜血管鋪片免疫組化染色
免疫組化染色方法參照文獻[2],略有改變： ①將視網膜血管鋪片置于 PBS 中水化 15 min; ②微波中火修復5 min; ③3%雙氧水封閉15 min; ④正常羊血清工作液封閉 20 min; ⑤滴加用抗體稀釋液稀釋的一抗 （ CD31 稀釋度為 1 ∶ 50; VEGF 稀釋度為1∶ 200） ,室溫孵育 1. 5 h; ⑥滴加二抗試劑 1,室溫孵育 10 min; ⑦滴加二抗試劑 2,室溫孵育 10 min; ⑧DAB 顯色； ⑨蘇木素復染 4 s; ⑩梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片2 結果。
2. 1 大鼠視網膜血管鋪片
經 HE 及 PAS 染色可見： 鋪片完整，清晰顯示血管走向。各級血管形態清晰，血管分支清楚完整，無斷裂現象。細胞形態清晰，細胞核可清晰顯示（ 彩插 12 圖 1） .
酶消化會造成部分抗原的丟失，因此需要對抗原進行修復。修復溫度太低造成修復不完全，溫度太高又會脫片。經過摸索，我們發現，微波中火5min 即可將抗原修復。免疫組化結果顯示： CD31和血管內皮生長因子 （ vascular endothelial growthfactor,VEGF） 在正常大鼠鋪片均有表達： CD31 在血管周細胞及內皮細胞均有表達； VEGF 主要在內皮細胞表達。
2. 2 小鼠、狗、猴視網膜鋪片
根據大鼠鋪片經驗，我們摸索了 BALB/c 小鼠，犬和恒河猴的視網膜血管鋪片消化時間。經 HE 及PAS 染色，可見血管網完整，無神經組織殘留。各級血管結構清楚，大動物小動脈可顯示血管壁的平滑肌。毛細血管網由內皮細胞和周細胞組成，細胞形態清晰，細胞核結構清楚（ 彩插 12 圖 2） .
3 討論
1960 年 Kuwabara[3]用胰蛋白酶對視網膜進行消化制備了視網膜血管鋪片，為視網膜血管的研究提供了一種新的手段。1963 年 Ashton[4]改進了Kuwabara 的方法，用胃蛋白酶 - 胰蛋白酶聯合消化法，成功制備了貓的視網膜血管鋪片。此后又經過各國學者的不斷努力[5 -8],才有了今天的技術基礎。
視網膜血管消化鋪片技術難度較大： 消化不完全，鋪片不能充分顯示出血管。消化過度，又會造成血管結構不清晰，甚至斷裂，直接影響對實驗結果的觀察和分析。蛋白酶 K 是一種高活性蛋白酶，能快速、有效地裂解組織細胞，因此在本研究中，我們選擇先用蛋白酶 K 消化掉視網膜感光層細胞。
同時，蛋白酶 K 能穿透細胞膜，破壞細胞核，于是我們將視網膜層漂洗后再移入到 3% 胰蛋白酶中進一步消化。應用蛋白酶 K - 胰蛋白酶聯合消化法，成功制備了不同實驗動物的視網膜血管鋪片。
視網膜血管鋪片制備過程中，應注意以下幾點： ①眼球的固定： 大、小鼠眼球取材后直接固定于10% 中性福爾馬林 24 h 以上。狗和猴眼球組織結構特殊，各部分組織結構的軟硬度不同，因此取材后立即固定4 h,再用鋒利的刀片在眼球的上下部各切開一個小口，繼續固定 24 h.由于固定液易造成視網膜血管的斷裂，因此固定時間最好不超過72 h.②視網膜的剝離： 視網膜位于眼球壁的內層，組織比較薄，而且附著在色素層上，剝離過程中很容易破碎。因此去除晶狀體后，以視神經乳頭為中心，將眼球壁剪開成若干等份，輕輕剝離出視網膜。③血管的消化： 消化過程中，隨時注意觀察。蛋白酶 K消化能力極強，每 5 min 輕微搖動一次，再以最低完成消化時間為觀察起點，每 2 min 輕柔搖動一次，待肉眼可見感光層脫落即可終止消化。換成胰蛋白酶消化時，每 10 min 輕微搖動一次，再以最低完成消化時間為觀察起點，每 5 min 輕柔搖動一次，待可見半透明血管網即終止消化。④鋪片： 將消化好的血管網漂洗干凈，平鋪于含多聚賴氨酸的載玻片上，不要將載玻片上的水吸干凈，否則未貼壁的血管網漂移，影響對血管走向的觀察。⑤抗原修復：常規微波修復石蠟切片需要高火3 min,中火5 min,再低火 3 min.而視網膜血管鋪片只需中火 5 min即可完成抗原修復。
蛋白酶 K-胰蛋白酶聯合消化法制備大鼠視網膜血管鋪片成功率高，穩定性好，同時也適用于不同實驗動物，為視網膜血管性疾病的研究提供了重要途徑。
參考文獻：
[1] 李彥紅，朱華，徐艷峰，等。 過敏性紫癜兔模型的免疫學改變及機制初探[J]. 中國實驗動物學報。 2013,21（ 6） : 65 -69.
[2] 朱華，徐艷峰，劉穎，等。 鏈脲佐菌素誘導糖尿病恒河猴胰島細胞數量的變化[J]. 中國比較醫學雜志。 2012,22（ 12） : 1- 3.
[3] Kuwabara T,Cogan DG. Studies of retinal vascular patterns. I.Normal architecture [J]. Arch Ophthalmol. 1960,64 （ 6） : 904- 911.
[4] Ashton N. Studies of the retinal capillaries in relation to diabeticand other retinopathies [J]. Brit J Ophthal. 1963,47（ 9） : 521- 538.
