神經干細胞（neural stem cells,NSCs）是一類分布于神經系統，具有自我更新并擁有多向分化潛能的干細胞，其主要分化為星形膠質細胞、神經元細胞及少突膠質細胞，替代受損的神經組織從而起到治療脊髓損傷的作用[1 -2].骨髓間充質干細胞（bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs）屬于成體干細胞的一種，不僅具有成骨、成脂等多向分化潛能，還能分泌多種神經營養因子[3],近年來利用 BMSCs與 NSCs 共培養技術治療脊髓損傷已成為研究熱點。有報道[4]指出，BMSCs 與 NSCs 共移植治療神經損傷療效優于單純移植 NSCs,說明 BMSCs 為NSCs 的生長與分化提供了一個更加合適的微環境。
然而，是 BMSCs 本身還是其分泌的營養因子發揮了作用仍值得探討。該研究利用富含營養因子的BMSCs 條件培養基體外培養 NSCs,去除 BMSCs 本身的影響，能夠充分了解 BMSCs 條件培養基對NSCs 增殖與分化的影響，為 BMSCs 條件培養基的應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 實驗動物 新生 24 h 內 SD 大鼠 1 只，雌雄不限；4 ~5 周齡 SD 大鼠1 只，100 ~120 g,購自安徽醫科大學實驗動物中心。
1. 1. 2 實驗試劑及儀器 DMEM /F12 培養基（ 美國 Gibco 公司）；DMEM 低糖、南美胎牛血清（美國HyClone 公司） ;B-27（ 美國 Invitrogen 公司）；表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）、堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）（美國PeproTech 公司）；小鼠抗大鼠巢蛋白（ Nestin） 抗體、兔抗大鼠膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidicprotein,GFAP） 抗體、小鼠抗大鼠微管相關蛋白-2（microtubule-associatedprotein-2,MAP-2）（美國 SantaCruz 公司）；小鼠抗大鼠髓鞘堿性蛋白（ myelin basicprotein,MBP）（英國 Abcam 公司）； FITC 標記的山羊抗小鼠 IgG、TRITC 標記的山羊抗兔 IgG、TritonX-100（北京中杉金橋生物技術有限公司）；CD29-PE、CD90-PE、CD34-FITC、CD44-FITC（美國 BioLegend公司）；多聚賴氨酸（美國 Sigma 公司）；MTT 試劑盒、胰 酶、免 疫 熒 光 稀 釋 液、多 聚 甲 醛、Hoechst33342、青鏈霉素（ × 100） （ 上海碧云天生物技術有限公司）；山羊血清（中國武漢博士德公司）；ECL 顯示試劑盒（美國 Pierce 公司）；CO2恒溫培養箱（美國SHEL LAB）；倒置顯微鏡 CKX41 （ 日本 Olympus 公司）；流式細胞儀（美國 BD FACSVerseTM）；熒光顯微鏡 DMI6000 型（德國 Leica 公司）。
1. 2 方法
1. 2. 1 大鼠 BMSCs 體外分離、培養、鑒定 采用本課題組前期的實驗方法[5]從大鼠骨髓中分離并培養出 BMSCs,取生長良好的第 3 代 BMSCs,胰酶消化后制成單細胞懸液，計數，參照之前的方法，行細胞表面標記 CD90、CD34、CD29 的流式細胞儀檢測。
1. 2. 2 大鼠 BMSCs 條件培養基的制備 取第 3 代生長良好的 BMSCs,待細胞長至約 90 % 密度時，棄去原培養基，PBS 洗滌 3 次，每次 5 min; 加入DMEM / F12 培養基繼續培養 48 h 后，收集濃縮上清液，按前期實驗比例配制成 NSCs 增殖與分化條件培養基。
1. 2. 3 大鼠 NSCs 的分離、培養、鑒定 取新生 24h SD 大鼠幼鼠，處死后置于 75% 酒精浸泡 5 min;在無菌條件下分離出大腦半球，剪碎，加入 0. 25% 胰酶消化 10 min,輕輕吹打混勻后經篩網過濾成單細胞懸液；加入增殖培養基（DMEM/F12 +2%B27 +20ng / ml bFGF + 20 ng / ml EGF + 鏈霉素 0. 1 mg / ml +青霉素 100 U/ml），600 r/min 離心 5 min 2 次，棄上清液；吹打混勻后以 3 ×105/ ml 接種于培養瓶中，置于 37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每 3 d 半定量換液1 次，培養 7 d 后傳代。
取第 2 代培養 7 d 的細胞球，600 r/min 離心 5min,棄上清液，接種于經 0. 1 mg/ml 多聚賴氨酸包被蓋玻片的 6 孔板中，置于 37 ℃培養箱 6 h,使懸浮干細胞貼壁。用 PBS 洗滌 3 次，每次 5 min;4%多聚甲醛固定后，PBS 洗滌 3 次，每次 5 min.在含0. 3% TritonX-100 中孵育 10 min,PBS 洗 3 次后，加入正常山羊血清封閉液，置于 37 ℃ 細胞培養箱內孵育 1 h 后，加入 1 ∶ 50 稀釋 Nestin 一抗，4 ℃ 條件下孵育過夜。次日常溫下放置 2 h,PBS 洗滌 3次，每次 5 min,加入 1 ×100 稀釋 FITC 標記的山羊抗小鼠 IgG,37 ℃ 細胞培養箱內避光孵育 1 h.最后行 Hoechst 溶液核染后封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。
1. 2. 4 大鼠 NSCs 分化及分化后鑒定 取第 2 代培養 7 d 的 NSCs 球，600 r/min 離心 5 min,棄上清液；加入分化培養基（DMEM/F12 + 2% B27 + 鏈霉素 0. 1 mg/ml + 青霉素 100 U/ml +10% FBS），吹打混勻后，接種于經 0. 1% 多聚賴氨酸包被蓋玻片的6 孔板中；置于 37 ℃ 、5% CO2培養箱中培養 1 周，每 3 d 半定量換液 1 次。1 周 后，參照上述免疫熒光方法，行神經元特異性蛋白 MAP-2、星形膠質細胞特異性蛋白 GFAP、少突膠質細胞特異性蛋白MBP 的免疫熒光染色。
1. 2. 5 大鼠 BMSCs 條件培養基在增殖情況下對大鼠 NSCs 增殖的影響 取第 2 代培養 7 d 生長良好的 NSCs,600 r/min 離心 5 min,吹打均勻。實驗組換用 BMSCs 條件培養基在增殖條件下放入 96 孔板中培養，每孔細胞數約 2 ×104個，對照組放入 96 孔板中繼續增殖培養基培養。分別在培養 1、3、5 d時，每次每組取 6 孔行 MTT 檢測，利用細胞生長曲線的繪制，了解大鼠 BMSCs 條件培養基在增殖條件下對 NSCs 的影響。MTT 檢測：每孔加入 5 × 10- 3g / ml 的 MTT 溶液 20 μl,置于 37 ℃ 溫箱 4 h 后取出，棄上清液；每孔加入 DMSO 150 μl,振蕩 10 min混勻后，用酶標儀測定光密度（optical density,OD）值；每個樣品取 6 孔，算出平均值后繪制曲線。
另外，取第 2 代培養 7 d 生長良好的 NSCs 接種至 6 孔板中，每孔接種細胞數為 1 × 106,培養方法同上，觀察細胞形態變化。在培養第 5 天時，實驗組與對照每組取 3 孔，在顯微鏡下（ ×100），按照雙盲法，每次每組各取 10 個視野對 NSCs 球進行計數，同時每組選取 10 個細胞球利用 Image J 圖像處理軟件測量其直徑（直徑的最大值/2 + 最小值/2）。
1. 2. 6 大鼠 BMSCs 條件培養基在分化情況下對大鼠 NSCs 分化的影響 取第 2 代培養 7 d 的 NSCs球，600 r/min 離心 5 min,棄上清液，重懸后計數，接種于經 0. 1% 多聚賴氨酸包被蓋玻片的 6 孔板中，每孔細胞數約 1 ×106.實驗組換用大鼠 BMSCs 條件培養基在分化條件下培養，對照組在無條件培養基條件下分化。置于 37℃、5% CO2培養箱中培養 1周，每 3 d 半定量換液 1 次。1 周后，分別提取分化后細胞總蛋白并測定蛋白濃度，根據蛋白濃度選擇上樣量，依次行電泳、轉膜、封閉；加一抗于 4 ℃ 孵育過夜，次日洗膜，加入相應蛋白二抗，室溫孵育 2h,充分洗滌后顯影、定影。所使用抗體及稀釋度：
MAP-2（小鼠單抗，1 ∶ 200 稀釋），GFAP（兔多抗，1 ∶ 500 稀釋），MBP（ 小鼠單抗，1 ∶ 500 稀釋），β-ac-tin（ 小鼠單抗，1 ∶ 1 000 稀釋），二抗 （ 山羊抗鼠，1 ∶ 5 000稀釋；山羊抗兔，1 ∶ 5 000 稀釋） .膠片掃描后采用 Image J 軟件分析各組條帶的灰度值。
1. 3 統計學處理 應用 SPSS 11. 0 統計軟件進行分析，計量資料以 x珋 ± s 表示；兩組間均數比較采用獨立樣本 t 檢驗，組間差異采用單因素方差分析；所有實驗每次至少 3 組，獨立重復 3 次。
