將已分化的體細胞重編程為類胚胎干細胞樣細胞的技術完成于 2006 年. Takahashi 等[1]通過外源表達一組選擇性的轉錄因子導入成體小鼠成纖維細胞, 最終確定最少有 4 種轉錄基因組合---Oct4 \\(也稱 Pou5f1、Oct3 / 4\\)、Sox2、Klf4 和 c-Myc 可將成纖維細胞重編程為誘導性多潛能干細胞\\(iPS細胞\\).從此 iPS 細胞的研究開始成為干細胞研究領域的熱門,并且 iPS 細胞的來源也越來越廣泛.利用iPS 細胞誘導技術將終末分化細胞先誘導成 iPS 細胞,再進一步誘導成具有特定功能的細胞,如神經細胞,心肌細胞等,稱為誘導性細胞. 時至今日研究者已經開始嘗將 iPS 細胞應用于臨床治療.
1、誘導性多潛能干細胞的研究進展
從 iPS 細胞誕生之日起,iPS 細胞的研究就成為細胞研究領域的熱門. 起初, 研究者誘導 iPS 細胞時,iPS 細胞的誘導效率極低,而且他們用的是 4 個轉錄因子 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc,其中 c-Myc 還具有一定的致癌作用. 后來經過科學家們的不斷嘗試, 開始用小分子化合物、miRNA、mRNA 或蛋白質等導入細胞來誘導 iPS 細胞[1-6],轉錄因子的個數也從 4 個減少到 1 個,甚至只用小分子化合物等物質來誘導 iPS 細胞[7-9]. 近年來 iPS 細胞研究取得了突破性進展,如建立了人類疾病特異的 iPS 細胞,借助鋅指核酸酶和轉座子等介導的轉基因技術高效制備了無病毒的 iPS 細胞[10-13].
從 2007 年 Takahashi 等[2]和 Yu 等[3]先后將人的體細胞重編程為 iPS 細胞開始, 多種人類成體干細胞被重編程為誘導性多潛能干細胞, 但是直到2013 年 Trokovic 等[14]才將人類骨骼成肌細胞重編程為 iPS 細胞,他們通過逆轉錄病毒載體\\(圖 1\\)或仙臺病毒載體介導目的基因的異位表達,在無飼養層且含有適宜的培養基條件下,可以使人類骨骼成肌細胞達到和人類成纖維細胞一樣的重編程效率,再加入組蛋白脫乙酰酶抑制劑丙戊酸鈉 \\(VPA\\)、丁酸鈉\\(NaB\\)和 ALK4/5/7 抑制劑 SB431542\\(SB\\),能明顯提高人類骨骼成肌細胞重編程為 iPS 細胞的誘導效率.
到目前為止,除了人之外,小鼠、大鼠、猴子、綿羊、豬的 iPS 細胞系均已建立[15-19].iPS 細胞研究的意義重大, 它不僅為多潛能干細胞[20]的獲取提供了新的途徑,而且避免了傳統胚胎干細胞研究中存在的倫理問題,同時還解決了免疫排斥反應問題,為細胞的體外培養和誘導提供了平臺\\(圖 2\\),使人們在細胞和分子水平上研究人類多種疾病及其發病機理成為可能\\(圖 3\\),也為相應藥物的研發提供了便利. 正是由于 iPS 細胞技術使得整個細胞生物學研究發生了質的飛躍, 所以 Ya-manaka 榮獲了 2012 年的諾貝爾醫學獎. 當然,目前iPS 細胞的發生機制還不是十分明確, 還有待深入了解,iPS 細胞的誘導效率仍然很低,整個誘導過程相對繁瑣,費用比較昂貴,達到商業化、大眾化應用的地步還有些遙遠,這一切都有待進一步研究和開發.
2、誘導性細胞的研究進展
利用 iPS 細胞誘導技術, 通過導入特定的轉錄因子組合,再加入一些小分子化合物等物質,將終末分化細胞先誘導成 iPS 細胞, 再進一步誘導成具有特定功能的細胞,如神經細胞、心肌細胞等,稱為誘導性細胞或誘導性功能細胞. 到目前為止,已經在多種具有重要功能的細胞上誘導成功[21-23].
2.1 誘導性造血和血管祖細胞Park 等[21]在改進的無飼養層的內皮培養條件下, 利用了一組重組生長因子 [骨形態發生蛋白 4\\(BMP4\\)、血管內皮生長因子\\(VEGF\\)和 纖維母細胞生長因子 2\\(FGF2\\)]的最適組合,然后在成分明確的內皮細胞生長培養基\\(EGM-2\\)中附著低密度培養,用人類胚胎干細胞和人類誘導多潛能干細胞培育出大量的 CD34+CD45+造血祖細胞\\(表 1\\). 這些造血祖細胞出現在附著于內皮或基質的細胞層周圍,從某種意義上來說,這種方式與體內胚胎生血內皮的造血方式類似. 雖然之前已經證實由成纖維細胞衍生而來的 hiPSC 細胞系并不具備有效分化為造血內皮的能力, 但是這個培養體系能夠使 hiPSC 具有和 hESC 一樣分化為造血內皮的能力. 這個有效的分化體系可用于直接延時攝像和造血發生過程的時間進程研究等.
2.2誘導性神經細胞Kuo 等.在由海藻酸和多聚 γ-谷氨酸\\(γ-PGA\\)以及表面神經生長因子構成的水凝膠中將 iPS 細胞誘導成神經元. 這種由海藻酸和多聚 γ-谷氨酸\\(γ-PGA\\) 以及表面神經生長因子構成的水凝膠在整個誘導過程中發揮著重要作用,而孔隙結構、孔隙度和溶脹比也有一定的影響. 在這種水凝膠中,iPS 細胞分化的形態學圖像\\(圖 4\\)展示出神經元的特點.
在誘導 iPS 細胞向神經元分化的過程中, 表面神經生長因子可以增強 β Ⅲ微管蛋白的表達強度而抑制 SSEA-1 的表達強度.iPS 細胞在這種水凝膠中的分化可以通過 SSEA-1 和 β Ⅲ微管蛋白的表面抗原免疫化學染色和掃描電子顯微鏡來觀察鑒定.
2.3誘導性心肌細胞Jiang 等[23]使用從 Oct4-GFP-C57 小鼠身上獲得的心臟成纖維細胞\\(Cardiac fibroblasts,CFs\\)感染逆轉錄表達重組因子\\(Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc\\)來誘導功能性心臟細胞\\(Cardiomyocytes,CMs\\).以初代的小鼠胎兒成纖維細胞\\(MEFs\\)作為對照,試驗發現由 CFs 衍生而來的 iPS 細胞\\(CF-iPS\\)與胚胎干細胞\\(EBs\\)及 MEF 衍生而來的 iPS 細胞\\(MEF-iPS\\)具有同樣的生理學特性. 他們使用經典擬胚體的方法和Transwell CM 共 培養體系來模擬心肌旁分泌微環境,進而將 CF-iPS 向功能性心肌細胞誘導. 在模擬的心肌旁分泌微環境中,CF-iPS 自發地形成可以跳動的 EBs. 這些分化而來的能夠自發跳動的細胞可以表達心臟特有的組織特異性轉錄和結構因素,而且顯示出典型的心肌形態學和電生理特征.
當然,除了上述誘導性造血和血管細胞、誘導性神經細胞和誘導性心肌細胞外,還有其他的誘導性功能細胞也已經被人們所發現并認知. 如 Yam-aguchi 等[24]將小鼠的 iPS 細胞誘導成肥大細胞.
3、展望iPS 細胞
自誕生之日起即受到人們的關注,iPS細胞的研究開創了細胞生物學的新篇章,也極大地促進了表觀遺傳學和胚胎生物學的發展,為人類再生醫學和特異的細胞治療帶來了更美好的希望.如果供體細胞是來源于病人自身的體細胞,就可以避免免疫排斥反應問題,將這些體細胞先誘導成 iPS 細胞, 進而再誘導成具有特定功能的目的細胞,理論上就可以用于臨床醫學和再生醫學,這樣就有望實現個性化治療. 然而,到目前為止,誘導性功能細胞的種類有限,誘導效率也有待提高,并且細胞的功能仍需要大量動物模擬試驗驗證.目前,如何獲取更多的從終末分化細胞誘導而來的 iPS 細胞, 并進一步誘導成具有特定功能的細胞成為熱點, 對多種體細胞衍生的 iPS 細胞和多種新的培養誘導方法[25-28]也已經進行了嘗試.
盡管這種誘導的功能性體細胞在將來可能具有較高的應用價值,但是其中的詳細機理仍需要探索明確. 相信在胚胎干細胞研究、iPS 細胞研究、現代基因組學和 RNA 組學以及蛋白質組學的發展和帶動下,在不遠的將來,越來越多的誘導性功能細胞有望在臨床醫學和生物學基礎研究上發揮重要作用, 從而加快再生醫學和動物組織工程的發展,同時,也能促進發育生物學、表觀遺傳學和細胞生物學等基礎研究的發展.
參考文獻:
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