骨髓基質細胞\\(BMSCs\\)是干細胞及處于不同分化階段的前體細胞的混合物，具有自我更新能力及多向分化潛能。由于取材方便、創傷小，用于細胞移植和基因治療有許多優勢，具有很好的臨床應用前景。由于骨髓中細胞成分比較混雜，BMSCs 在骨髓中含量極少，僅占骨髓中有核細胞的 0． 001% ～0． 01%，實際應用中需對其進行體外分離純化并大量擴增。2010 年12 月 ～2012 年5 月，我們對人BMSCs 進行分離培養，對培養細胞的表面抗原進行測定并誘導其向脂肪細胞、成骨細胞分化，為深入研究 BMSCs 的組織再生和修復提供實驗基礎。
1 材料與方法
1． 1 材料
主要試劑:α-MEM 培養基、胎牛血清\\(FCS\\)購自美國 GIBCO 公司，細胞表面抗原檢測試劑 CD45、CD90、CD29、CD14、CD105抗體及其陰性對照抗體購自美國 BD 公司。主要設備:CO2恒溫培養箱\\(BB16/BB5060 Heraeus，德國\\)，超凈工作臺\\(北京昌平長城空氣凈化工程公司\\)，倒置相差顯微鏡\\(Nikon 801808，日本\\)，正置顯微鏡\\( Nikon E600，日本\\)，LDZS-2 低速自動平衡離心機\\(北京醫用離心機廠\\)，Caliber 流式細胞儀\\(美國 BD 公司\\)。
1． 2 方法
1． 2． 1 BMSCs
獲得和培養 骨髓來源:1 例 24 歲男性顱腦外傷患者，無系統性疾病，術中用咬骨鉗將損傷顱骨板障剪成 0． 5 cm 直徑的小塊，置于無菌器皿中。BMSCs 培養:在無菌條件下取出顱骨，放入直徑 120 mm 的培養皿;用無血清 α-MEM 培養基沖洗骨松質，將骨髓沖出;反復吹打含有骨髓的沖洗液，用 150 目銅網過濾;濾液以 1 000 r/min 離心 5min，棄上清。用含 10% FCS 的 α-MEM 培養基重懸細胞，反復吹打制成單細胞懸液，接種于培養瓶中。
置于 37 ℃、5% 的 CO2恒溫培養箱中培養，72 h 后更換新鮮培養基，去除未貼壁細胞并繼續培養，每 3～ 4 d 更換新鮮培養基。待原代培養的細胞生長至80% 融合時，用 0． 25% 胰蛋白酶消化進行傳代培養，取第 3 代以后的細胞用于實驗。
1． 2． 2 體外培養
BMSCs 的形態學觀察 采用倒置相差顯微鏡，逐日觀察細胞生長情況和形態特征。
1． 2． 3 BMSCs
表面抗原檢測 采用直接免疫熒光染色流式細胞術，測定 BMSCs 表面抗原 CD45、CD90、CD29、CD14、CD105。
1． 2． 4 誘導
BMSCs 向脂肪細胞分化 取對數生長期的 BMSCs，以 5 × 103/ cm2接種于 6 孔板中，每孔內置 2 個高壓滅菌蓋玻片。分別各取 2 個 6 孔板作為實驗組，2 個 6 孔板作為對照組。48 h 后，實驗組更換脂肪誘導培養基\\(1μmol/L 地塞米松、0． 5mmol / L IBMX、10 μg / mL 牛胰島素、100 μmol / L 消炎痛、10% FCS 的 α-MEM\\) 進行脂肪細胞分化誘導，每隔 3 d 換液 1 次。對照組更換常規培養液。誘導 3 周后，分別取出蓋玻片進行油紅 O 染色。油紅 O 染色方法:細胞爬片用 PBS 洗 3 次，10% 中性甲醛固定 10 min，PBS 洗 3 次，油紅 O 染液中浸染20 min，PBS 洗4 次，Mayer 蘇木素\\(1 000 r/min 離心5 min 去雜質，取上清，用于染色\\) 復染 8 min，PBS 洗4 次，濕片，封片，顯微鏡下觀察。
1． 2． 5 誘導
BMSCs 向成骨細胞分化 取對數生長期的BMSCs 以5 ×103/ cm2接種于6 孔板中。分別各取 2 個 6 孔板作為實驗組，2 個 6 孔板作為對照組。
48 h 后，實驗組更換成骨誘導培養基\\(0． 1μmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μmol/L 抗壞血酸磷酸鹽、10% FCS 的 α-MEM\\)進行成骨細胞誘導，每隔3 d 換液 1 次。對照組更換常規培養液。誘導3 周后，取出蓋玻片進行 von Kossa 染色。von Kossa染色方法:10% 中性甲醛固定 30 min，蒸餾水漂洗3 次;加入 1． 0% 硝酸銀溶液，紫外線照射 1 h，蒸餾水漂洗3 次;加入5．0%硫代硫酸鈉溶液浸泡 2 min，蒸餾水漂洗 3 次;1% 中性紅復染 10 min，顯微鏡下觀察。
2 結果
2． 1 體外培養
BMSCs 形態學觀察 倒置相差顯微鏡下，剛接種的骨髓懸液中含有大量懸浮細胞，無細胞貼壁;72 h 后，發現少數細胞貼壁，呈梭形。細胞換液，將造血細胞棄去。貼壁細胞呈克隆性生長，細胞增殖后形態多樣，呈異質性，以長梭形細胞為主，亦可見三角形、多角形及扁圓形細胞。6 ～8 d 后細胞形成集落。傳代后，細胞形態趨于一致，呈長梭形，細胞排列緊密，可成漩渦狀。見插頁Ⅲ圖 6。
2． 2 BMSCs
細胞表面抗原檢測結果 流式細胞儀分析 BMSCs 表面抗原，表現為 CD45陰性、CD90陽性、CD29陽性、CD14陰性、CD105陽性。
2． 3 BMSCs
向脂肪細胞分化結果 實驗組油紅 O染色、蘇木素復染核后，鏡下觀察可見胞質內脂滴為橙紅色，胞核為藍色。實驗組 BMSCs 誘導后可見細胞內出現大小不等的脂肪滴，說明已被誘導為脂肪細胞;隨著誘導時間延長，含脂滴細胞逐漸增多，胞內小脂滴逐漸聚集成大的脂滴，見插頁Ⅲ圖 7。對照組 BMSCs 油紅 O 染色未見細胞內有脂肪顆粒。
2． 4 BMSCs
向成骨細胞分化結果 實驗組成骨誘導后 BMSCs 變為多角形，細胞逐漸向多中心聚攏，形成鈣結節;von Kossa 染色可見細胞間出現黑褐色致密圓形鈣化結節，結節大小不均，周圍有細胞聚集，誘導后細胞密度降低，見插頁Ⅳ圖 8。對照組僅少數細胞胞質內有淺褐色顆粒，未見鈣化結節，且細胞密度很大。
3 討論
BMSCs 是干細胞及處于不同分化階段的前體細胞的混合物。20 世紀 70 年代，Friedenstein 等首先發現骨髓標本在培養過程中小部分貼壁細胞能分化形成類似骨、軟骨的集落，并命名為 BMSCs。BM-SCs 也具有自我更新能力及多向分化潛能，在體外經誘導可以分化為骨、軟骨、脂肪組織、神經組織及肝組織等。由于骨髓來源豐富，取材方便，創傷小，在組織再生和損傷修復中有很好的臨床應用前景。
本實驗中我們采用人骨髓組織，選擇了密度梯度離心法及貼壁篩選法對 BMSCs 進行分離純化及培養。倒置相差顯微鏡對所培養的細胞進行連續觀察，發現剛接種的骨髓懸液中含有大量懸浮細胞，無細胞貼壁;72 h 后，發現少數細胞貼壁，呈梭形。細胞換液，將造血細胞棄去。貼壁細胞呈克隆性生長，細胞增殖后形態多樣，呈異質性，以長梭形細胞為主，亦可見三角形、多角形及扁圓形細胞。6 ～ 8 d后細胞形成集落。傳代后，細胞形態趨于一致，呈長梭形，細胞排列緊密，可成漩渦狀，符合 BMSCs 的形態學特征。
為了進一步鑒定培養細胞為 BMSCs，本實驗對其表面抗原 CD45、CD90、CD29、CD14、CD105進行檢測，結果 CD90、CD29、CD105陽性，CD45、CD14陰性。一般認為，體外培養的間充質干細胞不表達分化相關的細胞標志，也不表達造血干細胞系的表面標志，如CD14、CD34以及白細胞分化抗原 CD45等，但表達sH2、SH3、CD90、CD44、CD29、CD71、CD106、CD120a、CD124和多種表面蛋白。因此，本實驗培養細胞的免疫表型符合 BMSCs 的免疫表型。
BMSCs 具有多向分化潛能，在細胞移植和基因治療方面有重要優勢。研究表明，BMSCs 在體內可持續表達端粒酶活性，在體外可分化成骨、軟骨和脂肪組織?？寺》治霰砻?，部分 BMSCs 可在體內分化成新骨。Caspase-3、端粒酶對 BMSCs 的成骨分化起重要作用。本研究通過對實驗組分別更換脂肪誘導培養基和成骨誘導培養基，誘導其分別向脂肪細胞、成骨細胞分化。誘導后，脂肪細胞分化組油紅 O 染色可見細胞內出現大小不等的脂肪滴，說明已被誘導為脂肪細胞。隨著誘導時間延長，含脂滴細胞逐漸增多，胞內小脂滴逐漸聚集成大的脂滴。向成骨細胞分化誘導后細胞變為多角形，逐漸向多中心聚攏，形成鈣結節。von Kossa 染色可見細胞間出現黑褐色致密圓形鈣化結節，結節大小不均，周圍有細胞聚集，證明 BMSCs 已被誘導為成骨細胞?？傊?，本實驗成功對 BMSCs 進行分離、純化及培養，并誘導其向脂肪細胞、成骨細胞分化，為深入研究 BMSCs 的組織再生和修復提供了實驗基礎。
參考文獻:
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