人胚肺二倍體細胞來源于人胎兒組織,具有正常的生物活性和功能性,對多種病毒敏感,而不誘發癌變,多用來培養病毒和制備疫苗。隨著科技的發展,更多的疫苗制品啟用二倍體細胞作為生產疫苗基質。其安全性及疫苗的免疫原性都有所提高。如水痘減毒活疫苗、甲肝疫苗常用的二倍體細胞株有2BS、MRC-5、KMB-17等。
采用人體同源的細胞作為細胞基質,疫苗質量逐漸上升,在免疫效果和安全性上都有所報道。由于人胚肺二倍體細胞生物學特性穩定,在延緩衰老藥物,病毒研究,醫學方面也得到了廣泛應用。本實驗通過對人胚肺二倍體細胞2BS株在兩種培養瓶中的培養特性比較,選擇更適合二倍體細胞生長的培養瓶,提高細胞質量和利用率,為各項研究提供優質的細胞。
1 材料與方法
1.1 細胞株
人胚肺二倍體細胞2BS株:27代,由長春祈健生物制品有限公司研究室提供,批號為20120320。
1.2 細胞培養瓶
玻璃方瓶\\(培養面積35cm2\\)由四川萬福玻璃儀器有限公司提供,T75培養瓶\\(培養面積75cm2\\)由美國Thermo公司提供。
1.3 主要試劑和儀器
MEM培養基\\(美國實驗室有限公司\\);新生牛血清\\(杭州四季青生物工程材料有限公司\\);谷氨酰胺\\(武漢大華偉業有限公司\\);碳酸氫鈉\\(北京化工廠\\);恒溫培養箱\\(日本三洋電器股份有限公司\\);倒置顯微鏡\\(重慶光學儀器廠\\),pH劑\\(上海精密儀器有限公司\\)、細胞計數儀\\(美國Inno-Alliance Biotech公司\\)。
1.4 細胞復蘇和連續傳代培養
從液氮取出保存二倍體細胞凍存管置于40℃水浴速溶。迅速將細胞混合均勻后以相同的接種濃度分別接種于T75培養瓶和玻璃方瓶中,并補足相應的細胞復蘇液,置于37℃恒溫培養箱中進行培養。
16—24h換復蘇液后繼續培養,并觀察細胞生長狀態。細胞培養至單層后,對細胞培養液進行PH測定。并經胰蛋白酶消化后,加入生長液吹打至細胞脫落混合均勻后細胞計數,按1:4比例連續傳代培養。觀察記錄各代次細胞的生長狀態及其它指標。
2 結果
2.1 細胞生長狀態比較
細胞傳代后顯微鏡觀察比較,T75培養瓶細胞長勢明顯優于玻璃方瓶。細胞貼壁迅速,分裂速度快,細胞密度大,胞質相對飽滿。
T75培養瓶內細胞前58代3天均可形成單層,細胞無明顯差異。當細胞傳代至58—68代時,細胞貼壁和增殖能力減弱,細胞表面有顆粒存在,,單層時間延長。68代以后,細胞急劇衰退。72代細胞呈網狀,不易成片無法單層。見圖1?！緢D1】
玻璃方瓶內細胞前48代3天均可形成單層,細胞生長狀態無明顯差異。當細胞在50—58代傳代過程中,細胞貼壁和增殖能力減弱,細胞變暗,細胞表面有顆粒存在,單層時間延長。60代細胞呈網狀,不易成片,無法單層。見圖2?！緢D2】
2.2 細胞計數
細胞傳代培養72h后,對兩種培養瓶內細胞經胰酶消化后,生長液稀釋10倍細胞計數比較,相同代次T75培養瓶單位面積細胞數明顯多于玻璃方瓶。T75培養瓶內細胞58代數量無明顯差異,58代以后細胞數開始減少;玻璃方瓶內細胞48代數量無明顯差異,48代以后細胞數開始減少;見表1?！颈?】
兩種培養瓶單位面積各代細胞計數:
2.3 PH 值變化
細胞傳代72小時后,兩種培養瓶內生長液PH測量比較,T75培養瓶內58代前液體PH值無明顯差異,58液體PH值升高明顯。玻璃方瓶內48代前液體PH值無明顯差異,48代后液體PH值升高明顯。見表2。兩種培養瓶中培養液PH變化:【表2】
3 討論
19世紀60年代人胚肺二倍體細胞株的建立,國內外對二體細胞的研究進入了一個新的階段,在多個領域得到廣泛的應用,由其為疫苗生產疫苗提供了良好的細胞基質。WHO對二倍體細胞在疫苗生產有著嚴格的要求,應經國家質控當局的批準和注冊。制備疫苗用人二倍體細胞不得超過細胞總平均壽命三分之二群體倍增的代次。所以延長二倍體細胞壽命,維持生物學特性穩定,才能充分利用二倍體細胞,提高細胞質量,生產出安全有效的疫苗。
隨著生物技術的不斷發展,疫苗的生產工藝不斷改進,目前國內疫苗企業正逐步淘汰傳統的轉瓶生產工藝進行細胞工廠培養,乃至生物反應器的規?；瘧?。本研究通過比較人胚肺二倍體細胞2BS株玻璃瓶和T75培養瓶兩種容器下培養,并進行極限傳代。通過倒置顯微鏡下觀察細胞形態,細胞計數,PH值測定等比較兩種容器培養的二倍體細胞的培養結果。2BS細胞在兩種培養瓶內極限傳代,當達到一定代次時,2BS細胞形態發生變化,增值能力減弱,代謝緩慢。但在T75培養瓶內連續傳代,細胞貼壁迅速,分裂速度快,細胞密度大,提高傳代代次,并延長細胞壽命,能更好的維持細胞生物學特性。T75培養瓶在使用過程中不用高壓滅菌處理,可以直接使用,方便快捷,操作簡單。減少人力。
參考文獻
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