0 引 言.

雌激素受體是雌激素作用于靶器官的重要路徑之一.雌激素水平、雌激素受體表達的差異,都會使細胞產生對雌激素的不同應答[1 -3].雌激素受體為配體依賴的類固醇超家族成員之一,有 α,β 2 種亞型,雖有高度同源性,但功能不同[4].骨髓基質干細胞具有高度自我更新和多向分化的潛能,可以定向或橫向分化為多種細胞[5],目前已成為生命科學中的研究熱點.作為雌激素靶器官的 BMSCs,不僅表達 ERα[6]

,更與 ERα 的生理功能相關.隨著對ER 研究的深入,有關 ER 的實驗要求也隨之越來越高,如何建立一個穩定的實驗平臺更好地進行相關研究成了迫切需要解決的問題.本實驗構建大鼠ERα 基因表達載體,并觀察其在 rBMSCs 中的表達,為進一步探討 ERα 的生理功能,尤其是在研究雌激素靶器官中的信號通路奠定基礎.

1 材料與方法.

1. 1 實驗動物 8 周齡雌性 SD 大鼠,4 只,購于北京大學醫學部動物中心.動物實驗合格證號: 京動字8910R018.動物實驗遵從實驗動物操作規范及倫理規范.SD 大鼠的飼養環境: 空氣充足,12 h 光照,室溫\\( 22 ±2\\) ℃,濕度45%~65%,自由飲食及飲水.

1. 2 實驗材料 胎牛血清\\( 美國 Gibco 公司\\) ,DMEM培養液\\( 美國 Hyclone 公司\\) ,總 RNA 提取試劑\\( 北京欣博盛生物技術公司\\) ,cDNA 合成第一鏈試劑盒\\( 日本Toyobo 公司\\) ,2 × Trans Taq HIFI PCR SuperMixⅡ\\( 北京全式金生物技術公司\\) ,限制性內切酶 BamHⅠ及 XhoⅠ、T4 DNA 連接酶、Prime STARTM HS DNA 聚合酶、pMD18-T 載體、DNA marker DL2000\\( 大連寶生生物有限公司\\) ,質粒抽提及膠回收純化試劑盒\\( 美國 QIA-GEN 公司\\) ,E. Coli 菌株 DH5\\( 上海第二軍醫大學生化教研室\\) ,pcDNA3.1\\(+\\) 質粒\\( 美國 Invitrogen 公司\\) ,rBMSCs\\( 廣州賽業公司\\) ,LipofectamineLTX 轉染試劑盒\\( 美國 Invitrogen 公司\\) ,兔抗大鼠 ERα、HRP 標記的羊抗-兔二抗\\( 美國 SouthernBiotech 公司\\) ,SYBR greenPCR master mix\\( 北京基諾來普試劑公司\\) .

1. 3 實驗方法.

1. 3. 1 免疫細胞化學染色 培養皿中置入預先切割好的薄蓋玻片\\( 1cm ×1 cm\\) ,細胞以 1 ×104/ cm2的密度接種于培養皿,使細胞在蓋玻片上貼壁生長,培養2 d.將爬滿細胞的蓋玻片取出,按照免疫組化染色方法,對細胞進行脫水、固定、破膜、一抗孵育、二抗孵育、顯色、透明,晾干后,中性樹脂封片,顯微鏡觀察.

1. 3. 2 大鼠 ERα基因的引物設計與 cDNA 合成①參照全長的 ERα 基因序列\\( GenBank 序列號 NM_012689\\) ,設計合成擴增大鼠全長 ERα 的引物,上游引 物 F-ER: 5'-GGATCCGCCGCCACCATGACCAT-GACCCTTCAC-3',下游引物 R-ER: 5'-CTCGAGAACT-CAGATGGTGTTGGGGAAGCCCT-3'.上游引物引入BamHⅠ位點,下游引入 XhoⅠ位點.引物由上海生工生物工程有限公司合成并經 PAGE 純化定量.②大鼠子宮及雙側附件勻漿,Trizol 抽提 RNA.RNA 電泳檢測結束后,對 RNA 濃度和 A 值進行測定.反轉錄按照 Toyobo 反轉錄試劑盒 First Strand cDNA SynthesisKit 說明書進行.對于所用的試劑均用 DEPC 處理水配制,置于冰上,在超凈工作臺上操作.

1. 3. 3 ERα 的 PCR 擴 增 ① PCR 反應體系為:

cDNA 5 μL,M 正向\\( F\\) 引物\\( 10 μmol / L\\) 1 μL,M 反向\\( R\\) 引物\\( 10μmol/L\\) 1μL,2 ×Trans Taq HIFI PCRSuperMi ×Ⅱ 12. 5 μL,去離子水 5. 5 μL,終體積為25 μL.②PCR 反應條件為: 94 ℃ 3 min→40 × \\( 94 ℃30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 1 min→72 ℃ 5 min→4 ℃ ∞ ,共35 個循環.③擴增結束后,取 PCR 產物 5 μL 在 1%的瓊脂糖凝膠電泳上進行擴增產物檢測分析.

1. 3. 4 重組 pcDNA3. 1\\(+\\) 表達質粒構建及鑒定 按照 DNA 回收試劑盒的說明,回收純化 PCR 產物,與 T載體連接,用于轉化感受態大腸埃希菌 DH5α.將轉化的感受態細菌涂布于含氨芐青霉素的瓊脂培養平板.挑選生長菌落,堿裂解法提取質粒 DNA,以BamHⅠ+ XhoⅠ酶切鑒定,并測序證實.

1. 3. 5 pcDNA3. 1\\(+\\) /ERα 質粒轉入 rBMSCs ①將復蘇成功并進入對數生長期的 rBMSCs 以 2 ×105個/孔的密度,接種于6 孔板,加入無抗生素的 DMEM,每孔2 mL.②37 ℃ 孵箱孵育至細胞鋪滿孔板的 60% ~80% .轉染前 1 d,確定細胞形態正常,培養液顏色、性狀正常.③按照 LipofectamineLTX 試劑盒說明書操作,轉染0.2μg 重組質粒于 rBMSCs,同時轉染空質粒作為對照,37 ℃培養箱培養 5 ~ 7 h.④去除培養液,加入含 10% 胎牛血清的 DMEM,繼續培養,48 h后,提取細胞用做后續實驗.

1. 3. 6 RT-PCR 及 Western blotting 檢測鑒定轉染后產物①收集轉染 pcDNA3.1\\(+\\) /ERα 后的rBMSCs,按照1.3.2與1.3.3 的方法提取總 RNA,RT-PCR 檢測 ERα mRNA的表達情況.②收集轉染 pcDNA3. 1\\(+\\) /ERα 后的rBMSCs至 1. 5 mL 離心管,離心半徑 10 cm,離心轉速為5000 r / min,離心 5 min 后棄去培養液,加 10 倍體積的細胞裂解液于4℃裂解細胞沉淀30min,加適量的5 ×樣緩沖液混合,100℃煮5min; 離心1min,取上清電泳.將電泳后的蛋白轉至PVDF 膜,TBS 緩沖液洗膜、封閉,4℃過夜.加入兔抗大鼠 ERα 抗體\\( 1∶1000\\) 作為一抗,4℃過夜.HRP 標記的羊抗兔抗體作為二抗,37℃孵育1h.

TBST 漂洗 PVDF 膜,ECL 化學發光顯色.

1. 3. 7 MTT 檢測 將細胞懸浮于含 10% 胎牛血清的 DMEM 中,以 104個細胞/孔的密度接種于 96 孔板,每孔200μL.根據實驗設計,選取不同的時間點進行 MTT 檢測.將 25 mg/mL 的 MTT20 μL 加入待測孔,37 ℃ 孵育 4 h.去除上清液,加入 150 μL 的DMSO,震蕩 10 min.選取 490 nm 的波長,在酶聯免疫檢測儀上,檢測每孔的光吸收值,記錄數值.

1. 3. 8 Realtime-PCR 檢測 ①引物設計與合成 ERα:5'-GGATCCGCCGCCACCATGACCATGACCCTTCAC-3',5'-CTCGAGAACTCAGATGGTGTTGGGGAAGCCCT-3';β-actin: 5'-ACCTTCTACAATGAGCTGCG-3',5'-CCTG-GATAGCAACGTACATGG-3'.②提取 RNA 后,以反轉錄好的 cDNA 做為模板,進行 Realtime-PCR 實驗.

PCR 反應體系為: SYBR Green 熒光燃料 MIX 5 μL,引物 UP\\( 10μmol/L\\) 0.5μL,引物 Down\\( 10μmol/L\\) 0.5μL,cDNA 第 1 條反應產物 2 μL,去離子水 2 μL,總體積 10 μL.③Realtime-PCR 反應程序: 95℃ 5 min→95 ℃ 30 s→40 × \\( 62 ℃ 30 s\\)→4℃∞.④溶解曲線反應程序:95℃ 15s→60℃ 15s→95℃ 15s.

1. 4 統計學分析 采用 SPSS 12. 0 統計軟件進行單因素方差分析,實驗數據采用均數 ± 標準差\\( x ± s\\) 表示,兩兩組間比較用 LSD 檢驗.以 P≤0. 05為差異有統計學意義.

2 結 果.

2. 1 免疫組化染色 以 MCF-7 細胞為陽性對照,rBMSCs 的細胞核、細胞質中都可見 ERα 陽性棕色顆粒表達,以細胞質表達為多,見圖 1.

2. 2 重組質粒 pcDNA-ERα 的構建及鑒定 抽提大鼠子宮及雙側附件總 RNA,以 1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定.結果顯示,抽提的 4 只大鼠的總 RNA 均完整.將抽提的總 RNA 逆轉錄,以合成的 cDNA 為模板,PCR 擴增全長 ERα 基因.將 PCR 產物純化回收,克隆入載體,以 BamHⅠ+ XhoⅠ酶切篩選出陽性重組子,并進行 DNA 測序,測序結果顯示與 GenBank 公布序列\\( 序列號: NM_012689\\) 完全吻合\\( 結果未顯示\\) .重組質粒 pcDNA3. 1\\(+\\) /ERα 引入 BamHⅠ+XhoⅠ酶切位點,酶切鑒定,見圖 2.

2. 3 重組質粒在 rBMSCs 中表達 分別提取瞬時轉染組[rBMSCs-pcDNA3. 1\\(+\\) /ERα]、空載體轉染組[rBMSCs-pcDNA3.1\\(+\\) ]、空白對照組\\( rBMSCs\\) 細胞總 RNA,做逆轉錄 PCR.取 RT-PCR 產物行 1%瓊脂糖凝膠電泳,結果顯示,在 β-actin 一致的條件下,瞬時轉染組細胞 ERα 的表達與正常組、空載體轉染組細胞相比有明顯升高,表明 pcDNA3. 1\\(+\\) /ERα 轉入細胞后,成功增加了 ERα 基因表達,見圖3a.

分別提取瞬時轉染組[rBMSCs-pcDNA3.1\\(+\\) /ERα]、空載體轉染組[rBMSCs-pcDNA3. 1\\( +\\) ]、空白對照組\\( rBMSCs\\) 細胞蛋白,做免疫印跡分析.Westernblotting 顯示,ERα 蛋白在空轉染組和對照組細胞均有表達,而在轉染組條帶明顯增強,表明重組質粒轉入細胞后,成功增加了 PELP1 的蛋白表達,與基因水平鑒定結果相一致,見圖 3b.

2. 4 重組質粒轉染前后對細胞生長的影響 MTT 顯示,ERα 的高表達對細胞的生長產生了抑制,但3 組細胞之間的生長曲線趨勢未發生明顯變化,見圖 4a.

Realtime-PCR 顯示,在 3 組不同處理的細胞組中,ERαmRNA 的表達存在差異,證明載體轉入細胞后有效,在 mRNA 的水平成功增加了 ERα 的表達,見圖4b.

3 討 論

高表達載體的建立,目前應用的有多種方法[7 -8].為了最大程度地保證產物與模板的一致性,實驗利用真核表達載體上的多克隆位點和重組質粒的酶切位點,將 ERαcDNA 定向連接于兩酶切位點間,成功構建了 ERα 真核表達載體,并通過脂質體轉染使 ERα 可以在 BMSCs 中高表達.實驗中選擇陽性菌落進行質粒小量提取[9],有利于簡化步驟,提高效率.

構建的真核表達載體經酶切并測序后,證實結果與預期一致,表明 ERα 的真核表達載體構建成功,可作為轉移 ERα 的工具.本實驗在選擇轉染方法上采用了瞬時轉染.因為穩定轉染需要進行較長的穩定篩選,骨髓基質干細胞不斷分化可能降低了其作為干細胞的特性.轉染前細胞的狀態與轉染效率密切相關.

骨髓基質干細胞為貼壁生長的細胞,對數生長期為32 h左右,轉染前 24 h 胰酶消化重新接種,轉染前 4 h更換新鮮培養液,可以最大限度保證細胞的良好生長狀態.基因轉入細胞后,對其表達的檢測受到時間限制,因為轉染了外源基因的細胞代謝負荷大,增殖較慢,過長的篩選時間會使細胞被沒有外源基因轉入的細胞淹沒,導致陽性克隆篩選失敗.本實驗在轉染 48h 后收集細胞進行檢測,在基因和蛋白水平均成功檢測出了 ERα 的高表達.

骨髓基質干細胞具有多向分化潛能,可在條件分化液的作用下向成骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、軟骨細胞等分化[10 -11].作為雌激素的靶細胞,本實驗也證明,骨髓基質干細胞在細胞核和細胞質中均表達 ERα.有研究表明,ERα 與骨髓基質干細胞的骨向分化能力正相關[7],參與細胞的多種生理功能.

選擇骨髓基質干細胞作為受體細胞,不僅可更深入地研究 ERα 功能,更能拓展骨髓基質干細胞的研究范圍,進而開拓更廣的臨床應用前景.

實時定量PCR 動力學較寬、在低表達水平下也可以分析基因表達的細微變化等,目前作為監測基因表達的有效工具[12 -13].實時定量檢測結果顯示了基因由外源性插入后,在細胞中表達的時間性變化.在 48h 時,基因的表達量達到峰值,隨后隨著培養時間的延長,基因表達水平隨之下降.本實驗選取 48 h 作為細胞檢測時間點,可提高檢測效率.MTT 檢測顯示,ERα 轉入細胞后,抑制了細胞的生長.推測外源性ERα 基因的插入,改變了細胞中 ERα 的核漿表達比例,使細胞對于外環境的應答發生了改變,進而影響了細胞的生長.但增殖曲線的變化不能完全說明ERα 的轉入對細胞生長的影響[6,14],因為外源基因的插入,細胞出現過負荷現象,自身的生長減緩,也會對生長曲線產生影響,需要進一步的實驗證明 ERα 高表達與細胞生長的相關性.

綜上所述,本實驗成功構建了 ERα 真核表達載體,使骨髓基質干細胞中 ERα 過表達,并對轉染后細胞的生理功能進行了初步探討,為 ERα 和骨髓基質干細胞的后續研究奠定了基礎.

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