持續的系膜增殖和系膜基質增多可導致不可逆性腎小球硬化〔1〕,抑制系膜細胞增殖是增殖性腎小球疾病重要的治療策略。S100A4 是 S100 基因家族成員，是一種鈣結合蛋白〔2〕,參與腎組織內上皮-間充質轉分化過程〔3〕,其對腎小球系膜細胞增殖是否有影響尚未見報告。本研究通過體外培養大鼠系膜細胞，探討降低 S100A4 表達對系膜細胞增殖的調控作用。
1 材料方法
1. 1 實驗材料 1640 細胞培養粉劑及 Tri201 試劑（ GIBCO 公司） ; MicroBCA 蛋白濃度檢測試劑盒、MTT（ Sigma 公司） ; 小牛血清（ Fetal bovine serum,FCS,Hycolon 公司） ; 羊 S100A4 抗體、小鼠 p21 抗體、小鼠 cyclinD1 抗體、小鼠 CDK2 抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠 IgG、羊抗兔 IgG、脂質體 TransPass R2Transfection Reagent（ Biolab 公司） ; M-MLV 反轉錄酶（ Invitrogenlife technologies 公司） ; PCR 試劑 （ TaKaRa Biotechnology 公司） ;ECL 顯色試劑盒（ Santa Cruz Biotechnology 公司） .
1. 2 大鼠腎小球系膜細胞系 RMC 的培養 雄性 Wistar 大鼠160 ~ 200 g 由吉林大學動物中心提供。無菌條件下取雙側腎臟，剝離腎包膜，腎皮質剪成碎塊，放于重疊的三層不銹鋼篩網上。收集第二層篩網上的組織移入離心管，V 型膠原酶（ 0. 5 mg/ml） 消化，15%胎牛血清的 RPMI 1640 培養液于37℃、5% CO2條件下培養原代的系膜細胞，7 d 傳代，經 Desmin（ +） 、Ⅷ（ -） 鑒定后，用于以下實驗。
1. 3 S100A4-15siRNA 的設計與合成 根據 Genbank 中大鼠S100A4-15 mRNA 全長序列（ AB020759. 1） 設計抑制 siRNA 的靶序列： 5'-AAGCCTTCTGTTCCTGCTACA-3',經上海吉瑪公司合成雙鏈 siRNA（ siS100A4） ,正義鏈： 5 '-GCCUUCUGUUCCUGCUACAtt-3',反義鏈： 3 '-ttCGGAAGACAAGGACGAUGU-5 '.同時合成無關 siRNA 序列作為對照（ siCon） : 正義鏈： 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3 ',反 義 鏈： 3 '-ttTTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5 '.合成的雙鏈 siRNA 用 DEPC 處理的水溶解至100 μmol / L,-20℃ 凍存備用。
1. 4 siRNA 轉染 細胞長至 50% ~ 60% 左右（ 以 12 孔板為例） ,進行如下轉染步驟（ NEB TransPass R2 試劑盒） : ①25 μlA 液加入 0. 6 ml 無血清 1640 培養液中，混勻。②再加入2. 5 μlB 液體，混勻。③加入終濃度為 100 nmol / L 的 siRNA（ siCon 或siS100A4） .④室溫靜置孵育 20 min.⑤期間待轉染細胞用無血清 1640 清洗 1 遍。⑥孵育液加到細胞培養皿，37℃培養4 h.⑦細胞中加 1 ml 正常 RPMI 1640 培養液（ 含血清） .⑧過夜培養。⑨更換新鮮的培養基培養 24 h 備用。
1. 5 細胞增殖的檢測
1. 5. 1 MTT 法檢測細胞增殖能力 大鼠系膜細胞 10 000 個 /孔接種于 96 孔板，無血清同步 16 h 后分為以下 4 組： ①無血清組； ②10%FCS 正常培養組； ③10% FCS+siCon 組； ④10% FCS+siS100A4 組，37℃ 孵育 24 ~ 48 h.在到達各時間點時棄去培養液，加入 MTT（ 終濃度 5 mg/ml） 20 μl,孵育 4 h,吸去上清，每孔加入二甲基亞砜（ DMSO） 200 μl,室溫溶解15 min,分光光度計490 nm 讀取 OD 值。每組設 6 個復孔，共重復 3 次。
1. 5. 2 流式細胞儀檢測細胞周期 系膜細胞傳代至25 cm2培養瓶中，無血清同步 16 h 后分組同上。培養 24 h 后收集細胞，PBS 液洗 2 次，加入 75% 乙醇固定，4℃ 過夜，次日離心后 PBS液洗 2 次，重懸于 0. 5 ml PBS 中。樣品經 RNA 酶（ 50 μg/ml）處理后，碘化丙啶（ PI,50 μg/ml） 室溫避光染色 30 min 后上機。應用 BD 流式細胞分析儀的 FACScan 測量 DNA 含量，細胞周期變化數據用 CellFIT Cell Cycle Analysis Version 2. 0 1. 2 軟件分析（ BD 公司） ,以細胞周期各時相細胞百分率記錄數據并分析。每組 3 瓶，重復 3 次。
1. 6 Western 印跡法檢測 S100A4 對細胞周期調節蛋白 p21、cyclin D1、CDK2 表達 系膜細胞傳代至 25 cm2培養瓶中，轉染、無血清同步 16 h 后分組同上； 培養48 h 后0. 25%胰酶消化收集細胞。Western 印跡法步驟同上： 最后分別加入小鼠 cy-clinD1 抗體（ 1 ∶100 稀釋） 、小鼠 p21 抗體（ 1 ∶ 100 稀釋） 、小鼠CDK2 抗體（ 1 ∶100 稀釋） 、兔 β-actin 抗體（ 1 ∶1 000 稀釋） ,室溫孵育 4 h; TBST 洗膜 3 次，分別加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠 IgG（ 1 ∶1 000 稀釋） 、羊抗兔 IgG（ 1 ∶2 000 稀釋） ,室溫孵育45 min; TBST 洗膜 3 次； ECL 顯影。ALPHAIMAGER 2200 凝膠圖像分析系統半定量分析。
1. 7 統計學處理 計量資料采用 x±s 表示，MTT 實驗采用雙因素方差分析，其余采用單因素方差分析。兩兩比較采用 q 檢驗，采用 SPSS16. 0 軟件進行數據處理。
2 結 果
2. 1 MTT 檢測 S100A4 對系膜細胞增殖速率的影響 轉染抑制 S100A4 的 siS100A4 后 48 h 細胞數明顯低于正常對照組和無關 siRNA（ SiCon） 組（ P<0. 05） ,見表 1.【表1】
2. 2 S100A4 對系膜細胞周期的影響 siRNA 抑制 S100A4 組S 期細胞以及 S+G2/ M 期細胞數（ 增殖指數） 明顯低于正常對照組及無關 siRNA 轉染組（ P<0. 05） ,見表 2.【表2】
2. 3 Western 印跡法檢測周期蛋白 CDK2、cyclinD1 和 p21 的表達變化 siRNA 抑制 S100A4 48 h 后，細胞周期蛋白 CDK2和 CyclinD1 均明顯低于正常對照組及無關 siRNA 轉染組（ CDK2 10% FCS+siS100A4 組： 0. 61±0. 02 vs. 10% FCS 正常培養組： 0. 33±0. 01; 10%FCS+siCon 組 0. 35±0. 01 P<0. 05,n=3,CyclinD1 10% FCS+siS100A4 組： 0. 61±0. 02 vs. 10% FCS 正常培養組： 0. 51±0. 01; 10% FCS+siCon 組 0. 46±0. 01 P<0. 05,n =3） ; 同樣 p21（ 10. 45 ±0. 01,P <0. 05） 也出現類似的變化趨勢。見圖 1.【圖1】
3 討 論
本結果提示 S100A4 可能是細胞增殖的正調控因子，與其在心肌和平滑肌細胞的作用研究結果類似〔3 ~5〕.細胞周期的改變必然伴隨著細胞周期蛋白的變化。在人類增殖性腎炎組織中腎小球內 E2F1、cyclinD1、CDK2 等細胞周期相關調控因子的表達顯著上調〔6〕.本研究結果證實抑制 S100A4 可引起促進細胞進程的相關蛋白 CyclinD1 和 CDK2 的表達水平降低。但抑制細胞周期進程的基因 p21 卻同樣出現了下調，該基因的表達下調，可能是細胞周期負反饋調節的代償現象，雖然表達下調，但可能不足以抑制促進細胞周期進程的相關蛋白的作用。
參考文獻
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