繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學等各種“組學”之后，代謝組學已迅速發展成為系統生物學的一個重要分支。代謝組學是考察生物體系（細胞、組織或生物體）受刺激或擾動后（如將某個特定的基因變異或環境變化后） 其所有小分子代謝產物的變化或其隨時間的變化，用以研究生物體系代謝途徑的一種技術[1].區別于其他組學針對生物大分子水平的研究，代謝組學關注的核心是小分子代謝產物群的變化，進而從小分子代謝物變化的整體水平來揭示生命過程的動態變化和調控規律。根據研究對象和目的的不同，代謝組學的研究模式主要分為兩種[2-3]:非靶標代謝組學和靶標代謝組學。
非靶標代謝組學[2,4-5]研究較為普遍，旨在盡可能全面地分析生物樣本中所有代謝物（包括未知化合物），從總體上把握整體輪廓及其代謝變化規律，尋找潛在生物標志物，具有全局分析的優勢。但同時也存在一定的不足，如易遺漏一些低濃度物質的變化，達不到全局分析的目的；進行半定量分析，準確度不高，結果可信度較低；只是一個相對模糊的全景模式，對于不同的疾病和代謝路徑缺乏特異性。非靶標代謝組學分析較多地采用核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR） 和氣相色譜串聯質譜（gas chromatography-mass spectroscopy,GC-MS）技術平臺。
NMR能實現對樣品的非破壞性、非選擇性分析，滿足對盡可能多的化合物進行檢測的目標；GC-MS具有較高的分辨率和檢測靈敏度，并且有可供參考的標準譜圖數據庫，可以用于代謝物的準確定性分析。隨著新的分析方法的不斷發展，目前對于非靶標代謝組學的分析，往往通過組合不同的分析技術，以實現代謝組的全面分析。
靶標代謝組學[2,4]是對特定的目標代謝物的精確定性定量分析，主要研究特定結構功能類型的代謝物群，例如脂肪酸類、磷脂類、嘌呤嘧啶類或氨基酸類等。作為一種特定模式，可以根據非靶標代謝組學的研究結果，對特定的代謝物群進行定量分析，彌補非靶標代謝組學的不足。其主要優勢是可以利用建立的數據庫，結合多種代謝通路，對目標代謝物進行定量分析，準確度高，特異性強。但其缺點[6]是需依賴先驗知識，建立方法依賴于標準品，對于生物樣本代謝組信息的覆蓋仍有局限，不適用于大規模的代謝輪廓分析。靶標代謝組學分析主要采用基于質譜的分析技術，三重串聯四級桿質譜[7]（triple quadrupole/mass spectroscopy,QQQ/MS）因其在定量分析上的獨特優勢成為靶標代謝組學分析的首選。氣相色譜三重串聯四級桿質譜（GC-QQQ/MS）和液相色譜三重串聯四級桿質譜（LC-QQQ/MS）聯用技術可以對不同極性的目標代謝物進行高選擇性﹑高靈敏度和高通量的定量分析，完成對大量生物樣本潛在生物標志物的驗證。一般在 GC-MS系統上用選擇離子監測 （selected ion monitoring,SIM）或者在 LC-MS 系統上用多反應離子監測（mul-tiple reaction monitoring,MRM）進行靶向 MS/MS 分析[3],其中 LC-MS 因其樣品處理過程簡單、分析速度快等優勢，應用更為廣泛。本文主要介紹靶標代謝組學技術在不同代謝物群研究中的應用。
1 脂類化合物
脂類是一類低溶于水而高溶于非極性溶劑的生物有機分子。對于大多數脂類而言，其化學本質是脂肪酸和醇所形成的酯類及其衍生物。由于脂類結構復雜，功能繁多，生物樣本本身又相當復雜，因此迄今沒有一種分析手段能獨立完成系統的大規模脂類分析。常用的脂類物質分析技術有軟電離質譜 和 液 質 聯 用 , 如 電 噴 霧 電 離（electrosprayionization）質譜（ESI/MS）技術在脂類的表征、定性和定量分析中就發揮了重要的作用。隨著研究不斷深入，新的分析方法不斷建立，脂類代謝物數據庫不斷發展完善。
脂肪酸是構成人體脂肪和類脂的基本物質，是細胞膜磷脂的重要成分[8].研究表明[9-14],脂肪酸代謝紊亂與某些疾病的發生有著密切的聯系，檢測脂肪酸代謝的動態變化可用于研究機體從穩態發展為疾病的過程，或者機體在接受治療后由疾病恢復到穩態的過程。此外，脂肪酸含量變化也可作為某類疾病的生物標志物，用于疾病的預警和診斷。脂肪酸是由一條長的烴鏈和一個末端羧基組成的羧酸，烴鏈的長度和不飽和度很大程度上影響了脂肪酸的性質。脂肪酸的分析常采用 GC-MS 技術，但是該法提取和衍生化過程繁瑣；而 LC-MS 分析方法因樣品處理過程簡單而得到越來越多的應用。
近年來，短鏈脂肪酸（short chain fatty acids,SCFA）和支鏈氨基酸（branched chain amino acids,BCAA）因其在生理和病理過程中的重要作用，而受到研究者的廣泛關注。Zheng 等[15]采用氯甲酸丙酯（propyl chloroformate,PCF）衍生化的方法，用 GC-MS 同時測定喂食不同營養成分的家兔糞便樣品中SCFA 和 BCAA 的含量。在 pH 8 的水∶丙醇∶吡啶（V/V/V=8∶3∶2）反應液中加入 100 μl PCF 進行衍生，然后用正己烷對衍生后的產物進行兩步提取。該法衍生化效率高、檢測限低、回收率高，已成功用于正常人糞便、血漿及尿樣中 SCFA 和 BCAA 的檢測。
類二十烷酸也稱類花生酸，由二十碳多不飽和脂肪酸衍生而來，大多數的類二十烷酸是花生四烯酸的衍生物，如前列腺素類（prostaglandin,PG），凝血 唑惡 烷 類 （thromboxanes,TX） 和 白 三 烯 類（leukotriene,LT）。類二十烷酸是炎癥和氧化應激反應中的主要調節介質，也常作為某些病理狀態或癌癥的生物標志物。不同類型的二十烷酸化學性質可能不同，加上其相對不穩定性，使得類二十烷酸的全面定量分析變得困難。尿液中類二十烷酸的分析通常采用 GC-MS 或 LC-MS/MS,但一般需要復雜的樣品提取和衍生化過程。對于類二十烷酸的分析方法已有大量研究報道，但對于不同代謝通路產生的類二十烷酸的定量分析研究比較罕見。Sterz 等[16]使用超高效液相色譜-串聯質譜 （ultra performanceliquid chromatography-SIM-MS/MS,UPLC-SRM-MS/MS）建立了一種簡單靈敏的方法用于定量分析尿液中的類二十烷酸。相比于耗時復雜的固相提取方法，該研究采用了一種較為簡單的液液提取方法；此外，所有化合物進入質譜后，在選擇反應監測（selected reaction monitoring,SRM）模式下，經碰撞解離產生特征離子對，不需要進行衍生化，即可進行檢測，操作簡便。采用該法實現了對尿液中多種主要類二十烷酸的定量分析，包括 PG 類（PGE-M、PGF2a）、TX 類（TXB2）、LT 類（LTE4）及 12-羥基花生四烯酸等。該方法成功應用于吸煙者尿液中類二十烷酸的測定（吸煙和尼古丁的攝入會引起尿液中類二十烷酸水平的升高），證明了該法的適用性。
二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）在大腦中含量非常豐富，是一種對人體非常重要的ω-3 多不飽和脂肪酸，對維持大腦的正常功能具有重要作用。研究表明，DHA 含量變化和氧化作用的發生與神經退行性疾病相關；在某些病理狀態下，DHA 的氫過氧化物（hydroperoxy-DHA,HpDoHE）和氫氧化物（hydroxide-DHA,HDoHE）的含量也會有所增加?？梢妼τ?DHA 氫過氧化物和氫氧化物的鑒定和分析具有重要的臨床意義。Derogis 等[17]建立了一種靈敏度高、專屬性強的方法，用于定量分析 12 種主要 HpDoHE 和氫 HDoHE 的異構體。在該研究中，通過光致氧化合成 HpDoHE,然后進一步使用硼氫化鈉（NaBH4）還原得到 HDoHE.分離得到的異構體使用 LC-MS/MS 的 SRM 模式為每一個異構體創建相應的特征離子對，實現了對各個異構體的定量分析。采用該法測定大鼠血漿和腦中 HpDoHE及 HDoHE 異構體的含量，已證明其適用性。此外，該法可用于 HpDoHE 和 HpDoHE 衍生物的鑒定和定量分析，對于氧化脂質組的研究也具有重要的意義。
磷脂是生物組織中非常重要的一類脂質，不僅是生物膜的主要成分，并且作為重要的代謝物參與大量的生命活動（如細胞中信號轉導、膜固定及底物轉運等）。正是由于在生物體代謝過程中的重要作用，磷脂也成為脂質組學研究的一個熱點。質譜被廣泛應用于磷脂的分析，但由于離子抑制效應等因素，低豐度的磷脂往往較難檢測出來。在進行質譜分析前，對不同種類的磷脂進行預分離，可提高檢測的靈敏度和重復性。Kim 等[18]采用 HPLC-MS 從大鼠心臟和骨骼肌線粒體中分離檢測到 7 種磷脂類化合物（磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、心磷脂及單溶心磷脂），并且對其中 6 種（磷脂酰絲氨酸除外）進行了定量分析。該法優化了提取純化步驟，提高了靈敏度和重復性，為線粒體中磷脂類化合物的分析提供了一種較好的定性和定量分析方法。
鞘磷脂即鞘氨醇磷脂，在磷脂酶的作用下，可水解為磷酰膽堿和神經酰胺，這些代謝物在調節細胞生長、分化和程序性死亡的機制中發揮著重要的作用。Blaas 等[19]以 C6-鞘磷脂為內標，采用親水作用色譜-高效液相串聯質譜（HILIC-HPLC-ESI-MS/MS）對人體母乳中的鞘磷脂進行了定量分析；提取后的母乳樣品采用硅膠固相提取方法純化，分離得到的鞘磷脂經磷脂酶水解得到相應的神經酰胺，然后采用反相高相液相串聯質譜（RP-HPLC-ESI-MRM/MS/MS）對鞘磷脂進行了結構確證。該法為母乳中不同結構類型的鞘脂的研究提供了新的思路。
2 肉毒堿
肉毒堿是類維生素，是機體脂肪酸代謝必需的一種輔酶，可與長鏈脂肪酸結合形成?；鈮A，作為載體，將脂肪酸運送至線粒體基質中，完成 β-氧化；此外，在支鏈氨基酸的代謝中肉毒堿也發揮著重要的作用。血漿中肉毒堿和?；舛緣A的檢測，對于診斷由脂肪酸代謝紊亂引起的疾病具有很大的幫助。
Peng 等[20]采用串聯四級桿離子阱質譜（QTRAP-MRM-MS/MS）建立了一種快速準確的方法來分析肉毒堿和?；鈮A。該法無需衍生化，避免了以往文獻中存在的衍生化反應不完全及?；鈮A水解等影響因素；采用 HILIC 預先分離肉毒堿和?；鈮A，可以較好地分開各異構體，排除干擾物質的影響，避免假陽性結果。為考察方法的適用性，對 216名健康人和 116 名患者血漿中肉毒堿和?；鈮A進行檢測，結果發現 49 名患者為有機酸血癥或者脂肪酸代謝紊亂。
對乙酰氨基酚（paracetamol）是一種廣泛使用的止痛劑，過量服用會造成肝毒性或引起其他急性肝損傷。線粒體功能障礙和氧化應激損傷是對乙酰氨基酚導致肝損傷的重要作用機制。新研究發現，服用過量對乙酰氨基酚患者的血漿中谷氨酸脫氫酶活性增強，線粒體 DNA 的濃度增加，并將其作為線粒體損傷的生物標志物。但是這些標志物相對分子質量較大，要在細胞死亡或細胞膜破損時才能從細胞中釋放出來。McGill 等[21]采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜（UPLC-QTOF-MS），應用代謝組學的方法來篩選線粒體損傷的生物標志物。呋塞米（呋喃苯胺酸，furosemide）是一種利尿劑，也可以引起肝損傷，但給藥初期不會造成線粒體損傷，對小鼠分別給予過量對乙酰氨基酚和呋塞米，發現給予對乙酰氨基酚的小鼠血漿中 3 種?；鈮A的含量增加，而給予呋塞米的小鼠血漿中未發現?；鈮A含量的顯著變化，表明?；鈮A的含量變化也許可以作為小鼠線粒體功能障礙的特征生物標志物。采用該方法，檢測服用過量對乙酰氨基酚而致肝損傷的患者血漿中的?；鈮A含量，結果未發現?；鈮A的顯著變化。分析其可能的原因是患者在服用過量對乙酰氨基酚后，給予 N-乙酰半胱氨酸進行解毒，影響了?；鈮A的測定。為探究給藥后人血漿和小鼠血漿差異產生的原因，該研究小組對小鼠給予過量對乙酰氨基酚后給予 N-乙酰半胱氨酸，對小鼠血漿進行檢測，發現給予 N-乙酰半胱氨酸后?；鈮A的含量較給予對乙酰氨基酚后?；鈮A的含量有所下降。該方法中發現的小鼠線粒體損傷時可能的生物標志物-?；鈮A，對于尋找與線粒體損傷相關的人類疾?。ㄎ唇涍^ N-乙酰半胱氨酸治療）生物標志物提供了研究思路。
3 核苷類化合物
核苷類化合物是維持生命活動所需的基本物質，是構成 DNA 和 RNA 的基本物質，因其具有廣泛的生理活性，可以用于抗腫瘤抗病毒[22]等的治療。某些疾病的發生也與核苷類物質的代謝異常相關，因此，核苷類化合物含量的變化可以作為生物標志物，用于某些疾病的診斷[23-29].目前，HPLC、毛細管電泳（capillary electrophoresis,CE）、HPLC-MS 以 及 GC-MS 等分析方法已用于核苷類物質的分析。
謝玉萍等[30]采用 HPLC-ESI/MS/MS 技術，結合MRM 模式，建立了同時檢測 19 種核苷的方法。該方法具有靈敏度高、選擇性強、定量準確及分析速度快等優點，可用于分析不同生長狀態的大腸桿菌中核苷的種類和含量隨時間的變化趨勢。
Struck 等[27]建立了一種定量分析泌尿生殖系統癌癥患者尿樣中核苷的方法，利用 HPLC-ESI-QQQ/MS/MS 技術，結合 MRM 模式，在 17 min 內同時檢測 12 種核苷，觀察核苷代謝變化，為進一步研究核苷類物質作為癌癥生物標志物的可能性提供了方法。
Stentoft 等[31]建立了一種簡單且重復性好的前處理方法，采用 LC-MRM/QQQ/MS/MS 技術，同時準確定量分析了奶牛血漿中 20 種不同結構性質的嘌呤嘧啶代謝物，并且通過分析不同基質（血漿、尿液、牛奶）和不同物種（牛、雞、豬、大鼠、人）采集的血液中嘌呤嘧啶代謝物，考察了該方法的適用性。修飾核苷是機體的代謝產物，在轉錄后由多種特定的甲基轉移酶和連接酶作用于多聚核苷分子而形成，其作用與維系自身結構和調節功能有關。Li 等[32]收集了 25 名健康人和 51 名冠狀動脈疾?。╟oronary artery disease,CAD）患者的尿樣，預處理后，采用固相萃取法提取、純化甲基化的核苷，繼而采用 HPLC-ESI-SRM/MS/MS 技術共分析了 6 種甲基化的核苷（N3-甲基胞苷、N1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N2-甲基鳥苷 、N1-甲基鳥苷和 N2,N2-二甲基鳥苷），其中 N6-甲基腺苷在 CAD 患者與健康對照組尿液中的含量變化具有明顯的差異。表明尿液中N6-甲基腺苷的含量變化可能與冠狀動脈疾病相關。
Xia 等[29]采用 HPLC-UV/MS/MS 對 2 型糖尿病患者中糖尿病性腎病患者肌酐和嘧啶循環相關代謝物進行定量分析。發現患者血漿中胞嘧啶、胞苷、胸苷含量顯著增高，而尿苷、胸腺嘧啶及脫氧尿苷含量沒有顯著變化。該研究結果表明，胞嘧啶、胞苷、胸苷含量變化可用于糖尿病病情發展的檢測及治療效果的評價。
4 氨基酸類化合物
氨基酸（amino acid,AA）是構成蛋白質的基本單位，賦予蛋白質特定的分子結構形態；作為細胞的信號分子，可調節基因的表達和蛋白質的磷酸化級聯反應；AA 還能轉化為其他的物質（如丙酮酸鹽、2-氧化戊二酸和延胡索酸等） 進一步進入三羧酸循環，參與能量代謝。此外，AA 代謝作為中心碳代謝的重要部分，發揮著關鍵作用。越來越多的研究表明 AA 的代謝變化可用于疾病的分析[33-36].因此，建立一種簡單、可靠的 AA 定量分析方法具有重要的意義。AA 種類較多且結構相似，大部分沒有紫外和熒光響應，為提高分離度和檢測靈敏度，一般將其衍生化后再進行定性定量分析。已發展的 AA測定方法有很多，常見的有 GC-MS[37]、LC-MS[38-41]及CE-MS[42-44]技術。Piraud 等[45]利用 LC-MRM/MS 技術建立了一種新的無需衍生化來檢測 AA 的方法，為遺傳性 AA代謝紊亂的檢測提供了技術支持。Salazar 等[40]利用 6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯進行衍生化，采用穩定同位素標記和 MRM 模式，應用 AccQ·Tag-UPLC-ESI-MS/MS 技術對擬南芥葉提取物中的 AA 進行定量分析。該方法通量高，選擇性好，可以實現在 10 min 內檢測 38種代謝物，檢測限達 1.02 × 10-11mol/L,較其他方法靈敏度提高 1~5 個數量級。
慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmonarydisease,COPD） 是呼吸系統常見病之一。近年來，COPD 的基礎研究和治療方法都不斷深化。Ubhi 等[35]采用 LC-MS/MS 技術研究不同類型 COPD 患者血清樣品，檢測 34 種 AA 和二肽代謝變化，發現 AA 代謝變化可用于 COPD 的診斷及區分 COPD 的不同亞型。特別是 γ-氨基丁酸的含量變化可用于監測療效及具有惡病質的胰腺癌復發情況。
非對稱二甲基精氨酸（asymmetric dimethylargi-nine,ADMA）是一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）競爭性抑制劑[46],通過抑制血管內皮細胞 NOS抑制一氧化氮（nitric oxide,NO）合成，NO 合成和分泌減少，會導致血管張力調節機制受損[47].Yi 等[48]建立了一種 LC-ESI-SIM/MS 方法定量分析了 T2DM患者血漿中 L-精氨酸、ADMA 和對稱性二甲基精氨酸。研究發現與對照組相比，ADMA 的含量在 T2DM患者中顯著增高，表明 ADMA 的含量變化可能與心血管疾病相關。
5 結語
靶標代謝組學可用于驗證發現代謝組學提出的假說，進行基于假說的探索性實驗，針對特定代謝物，研究代謝模型。采用 MRM 技術和同位素稀釋或質量標簽標記的方法對篩選出來的標志物定量，進行臨床確證。代謝物的準確定量將使代謝組學研究更全面更可靠，有助于更清晰地研究疾病機制，達到疾病預警、指導和評價治療的目的。
靶標代謝組學和非靶標代謝組學各具優勢同時存在不足?？紤]到非靶標和靶標分析各自的特征和優勢，中科院大連化學物理研究所研究小組提出了擬靶向的概念[50].擬靶向技術方案的核心思想是將非靶向分析的高通量、無偏向的代謝物信息獲取和靶向方法的高特異性檢測和準確定量相結合，從而實現對待測樣本中已知及未知的多個代謝物離子靶標進行同時檢測。該法在保證檢測靈敏度及對代謝組信息覆蓋的同時，顯著提高了數據的線性范圍以及重復性等指標，保證了后續的基于代謝組數據的標志物發現及驗證?；谶@一概念，其實驗室先后建立了基于 GC-MS、LC-MS 的擬靶向方法，并應用于植物代謝組學[49-50]、血清肝癌標志物的篩選[51]及胃癌早期診斷標志物的發現[52]等研究。
為了使代謝組學研究更全面、結果更準確，應有效結合非靶標和靶標分析技術，兩種分析模式相結合，優勢互補。利用非靶標分析，從整體上把握代謝輪廓，鎖定關鍵代謝路徑，尋找潛在生物標志物；利用靶標分析方法對關鍵代謝物進行準確定量，研究其在時間和空間上的變化規律。
【參 考 文 獻】
[1] Nicholson JK,Lindon JC,Holmes E. Metabonomics: under-standing the metabolic response of living systems to pathophys-iological stimuli via multivariate statical analysis of biologicalNMR spectroscopic data [J]. Xenobiotica,1999,29（11）：1181-1189.
[2] Dunn WB,Broadhurst DI,Atherton HJ,et al. Systems levelstudies of mammalian metabolomes:the roles of mass spec-trometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy[J].Chem Soc Rev,2011,40（1）：387-426.
[3] Griffiths WJ,Koal T,Wang Y,et al. Targeted metabolomicsfor biomarker discovery [J]. Angew Chem Int Ed Engl,2010,49（32）：5426-5445.
[4] Roberts LD. Targeted metabolomics[M]. Massachusetts,U.S:John Wiley & Sons,Inc,2012:1-24.
[5] Fuhrer T,Zamboni N. High-throughput discovery metabolomics[J]. Curr Opin Biotechnol,2015,31:73-78.
