結核?。═uberculosis, TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacteria tuberculosis, Mtb）感染引起的慢性傳染性疾病。結核病在全球范圍內仍有著較高的發病率和死亡率。據WHO報道，全世界約有三分之一的人群被感染，每年約有800萬新病例發生，至少有200萬人死于結核病[1].結核病的治療，包括多藥物聯合治療，至少需要持續6個月，易對肝臟造成損害，并伴有其他副作用[ 2 ].多耐藥菌株（MDR），尤其是廣泛耐藥菌株（XDR）的出現，給結核病的治療帶來日益嚴峻的挑戰[3].
卡介苗（Bacille Calmette-Guerin, BCG）是目前用于預防結核病的唯一疫苗，自發現以來接種達40億劑[1],但并不能有效控制結核病的傳播。目前研究結果表明，卡介苗免疫保護力只能維持10~15年[4].因此卡介苗對新生兒有較好的免疫保護效果，能降低兒童重癥結核病的發病率，但對成人肺結核的保護效果并不明顯[3].基于卡介苗在成人中保護效力下降的現狀，結核病新型疫苗的研制和免疫策略的優化顯得格外重要。通過抗結核黏膜免疫應答機理的深入研究，增強機體對Mtb的黏膜局部和全身免疫應答的認識，有望使黏膜免疫疫苗成為結核疫苗研發的新策略。
本綜述將圍繞目前宿主抗結核黏膜免疫的研究進展，重點介紹黏膜免疫在結核疫苗研發中的作用和研究進展。
1 黏膜免疫應答與抗結核感染
黏膜免疫系統（mucosal immune system, MIS）是指由黏膜相關淋巴組織所組成的免疫系統。人體的黏膜面積達400平方米，黏膜免疫系統擁有人體80%的免疫細胞[5],是抵御病原微生物的第一道防線。研究發現黏膜免疫能夠同時激發黏膜局部和全身免疫應答[6].Woof等[7]發現在黏膜組織的免疫反應可能會導致其他的黏膜表面產生IgA抗體。這與在局部黏膜部位活化的B細胞還可以進入血液循環，遷移至遠處黏膜組織，并定位于該黏膜部位有關[8].
Mtb主要通過呼吸道傳播，由于呼吸道中存在大量的黏膜相關淋巴組織，黏膜局部免疫誘導的抗結核保護性免疫效應相對于其它部位更為快速和有效[9].Mtb進入呼吸道后，廣泛分布于呼吸道黏膜中的樹突狀細胞（dendritic cell, DC）作為最主要的抗原提呈細胞（APC），在攝取、遞呈抗原后可以激活T細胞，并輔助B細胞產生IgA[10].同時在Mtb感染中，樹突狀細胞也可以發揮吞噬細菌、激活T細胞、分泌IFN-γ的作用[11].Vordermeier等[12]發現，黏膜局部B細胞可以產生抗Mtb的體液免疫應答。B細胞通過表面多種表面分子（如BCR、CD40等）接受Mtb抗原刺激后，發生活化和分化為IgA產生細胞。IgA是黏膜免疫應答的重要特征性效應分子，其水平的高低是反應黏膜免疫是否強大的有效指標之一[13].Dullaers等[14]研究表明，黏膜局部IgA的產生細胞來源于生發中心，并在濾泡輔助T細胞（T follicular helper cell, Tfh）的輔助下產生，生發中心中的Tfh通過分泌TGF-β1和IL-21促進IgA抗體產生細胞的分化，并通過上調CCR10促進IgA漿母細胞歸巢到黏膜局部，分泌具有免疫保護作用的sIgA.
T淋巴細胞被認為是黏膜免疫中最主要的免疫效應細胞，占黏膜部位淋巴細胞總數的80%[13].機體感染Mtb后，黏膜中CD4+T細胞產生的IFN-γ能夠激活巨噬細胞，這是控制和消除Mtb的關鍵[15]CD8+T細胞可以參與被感染細胞的溶解與凋亡，也能殺傷細胞內的結核桿菌[16].樹突狀細胞和被激活的巨噬細胞釋放的IL-12、IL-18等可以進一步誘導自然殺傷細胞和各種T細胞的活化，協同殺死細菌[17].研究發現，黏膜相關恒定T細胞（mucosal-asso-ciated invariant T cell, MAIT）在宿主抗結核過程中可能也發揮著重要的生理作用。雖然還沒有來自于結核病患者黏膜局部的數據，但是Jiang等[18]研究發現，活動性肺結核患者的MAIT細胞在活動性結核病患者外周的數量明顯低于正常人群，并且其細胞表面程序性死亡-1（programmed death-1, PD-1）的表達明顯上調，表明活動期患者體內MAIT的數量不僅下降，同時可能功能也受損。
2 黏膜免疫與結核疫苗
接種疫苗是預防疾病的主要手段之一。疫苗能在使用后產生保護性免疫，待病原體感染時通過免疫記憶細胞的增殖快速免疫應答，產生效應細胞和效應分子。但目前正在研發的大多數候選疫苗，絕大部分屬于全身給藥，它們可以誘導很強的全身性免疫應答而忽略了黏膜局部免疫應答的保護作用。在抵御經由呼吸道傳播病原菌中，誘導局部及全身黏膜免疫應答，可通過黏膜進行接種，使疫苗發揮前哨的保護作用。Mtb在感染過程中首先經過黏膜播散，所以通過黏膜局部疫苗的使用，在黏膜局部產生有效的抗結核保護作用對于肺結核的防治也至關重要[19].通過黏膜免疫增強免疫保護作用的研究已有報道。如Shim等[20]研究發現，通過黏膜途徑接種流感疫苗，尤其是通過滴鼻途徑在黏膜和血清中可以誘導產生較高的IgA和IgG抗體水平。在結核疫苗研究中，Pepponi等[21]在小鼠呼吸道黏膜內注射Ag85B-Acr-RICs疫苗時，其特異性抗體和T細胞應答水平，包括抗原特異性T細胞產生IFN-γ的水平顯著提高。Doherty等[22]在小鼠和豬體內通過胃黏膜接種ESAT-6-Ag85B-MPLSE疫苗后，在脾臟內IFN-γ的產生水平明顯增高，而且體內結核菌落的數量顯著減少。
目前，研究比較深入的各類結核疫苗有減毒活疫苗、重組卡介苗疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗等。這些疫苗的研發過程中首先考慮的是皮下或是肌肉免疫途徑，忽視了黏膜免疫在免疫應答中的積極作用。選擇高效的免疫途徑、良好的佐劑和遞送系統是黏膜疫苗有效激發誘導黏膜局部和全身免疫應答的不可或缺的因素。
2.1 黏膜免疫途徑
黏膜免疫途徑，主要包括口服（胃腸道）途徑和鼻腔免疫（上呼吸道）途徑。鼻腔作為呼吸道的重要環節，生理環境溫和，抗原誘導免疫反應的閾值較低，能夠避免胃腸道的酸性環境及酶的作用對疫苗成分的破壞，故鼻腔免疫所需要疫苗的量較??；同時鼻黏膜上覆蓋有大量的樹突狀細胞，具有攝取抗原的先天優勢。而且人體鼻咽相關淋巴組織（NALT）具有抗原保留隱窩，而腸相關淋巴組織（GALT）不具備這樣的結構，所以鼻腔免疫途徑的免疫有效性優于口服途徑[23].
已有研究發現，通過使用腺病毒基因載體攜帶結核分枝桿菌蛋白Ag85A進行鼻腔內免疫強化，可以提高Ag85A抗原特異性T細胞在肺部及呼吸道內的記憶功能，協同增強卡介苗免疫接種對肺結核的保護作用[24].通過鼻內途徑，運送含有結核分枝桿菌抗原蛋白FbpA和HtpXd DNA的非致病菌可以誘導抗原特異性T細胞應答，并防止結核分枝桿菌的入侵[25].除此以外，Ag85B-ESAT-6蛋白通過鼻內接種疫苗途徑，可以降低結核分枝桿菌在肺內的感染幾率[26].編碼HSP65的DNA疫苗通過鼻免疫途徑能夠對結核分枝桿菌產生保護性免疫反應[27].Chen等[28]研究發現，與皮下注射疫苗相比，在通過鼻黏膜途徑接種疫苗抵御Mtb的時候，BALB/c小鼠的脾臟中產生更多的IFN-γ，并且肺部T細胞能夠更迅速地活化、增殖。Hoft等[29]在由卡介苗誘導的小鼠的鼻黏膜內接種Ad35后，機體誘導出的CD4+T細胞和CD8+T細胞的濃度高于皮下接種。Lyadova等[30]通過鼻黏膜途徑給小鼠接種卡介苗5周后，發現肺部總T淋巴細胞數和CD4+T細胞數都顯著增加，同時T淋巴細胞在抗原誘導下產生IL-5、IL-12、IFN-γ的數量顯著增加。
上述動物實驗研究表明結核疫苗鼻內免疫接種后不僅可以誘導黏膜局部的特異性免疫應答，同時還可以誘導肺部的特異性免疫應答，有效清除肺部病原菌。鼻內免疫途徑對黏膜局部和全身抗結核免疫應答都可以產生增強作用，在肺結核的防控的積極意義顯而易見，有望成為預防Mtb感染的有效策略。
2.2 黏膜免疫用佐劑
佐劑本身不具備抗原性，但是可以非特異性地增強機體對抗原的特異性免疫應答或改變免疫應答的格局，誘導更加有效的體液和細胞免疫應答[31].同時，佐劑的使用還可以解決黏膜免疫途徑易誘發免疫耐受、免疫應答減弱、持續時間縮短等問題[24].Dietrich等[32]研究發現，與無佐劑接種卡介苗相比，使用雙十八烷基二甲基溴化銨（DDA）作為卡介苗的免疫佐劑時可出現更明顯的T細胞免疫應答，增加抗結核效應。目前，已經有有效改善免疫應答的佐劑相繼被用于黏膜免疫疫苗的研制，包括有細菌毒素、CpG基序、免疫刺激復合物等。
細菌毒素中最主要的是霍亂毒素（cholera toxin,CT）和大腸桿菌不耐熱腸毒素（heat labile enterotoxin,LT），能提高抗原呈遞細胞（APC）呈遞抗原的能力[33].霍亂毒素可誘導樹突狀細胞分泌IL-1β，還可通過上調IL-10,下調IL-12,選擇性地影響細胞表面分子的表達，增強T細胞的調節活性[34].不耐熱腸毒素最大的優點是毒性較霍亂毒素低，可誘導產生IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3和黏膜sIgA,同時誘導Thl型和Th2型應答[33].但是霍亂毒素和不耐熱腸毒素具有的生物毒性阻礙了在人體中的應用，限制了其作為黏膜佐劑的廣泛使用。近年來CpG（Cytosine-Phosphate-Guanosine,CpG）基序作為佐劑的潛力也已得到廣泛認可。
CpG基序又稱DNA免疫激活序列，是一些以非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸為基序的寡脫氧核苷酸短序列，可誘導多種免疫細胞分泌各種細胞因子、誘導B細胞分泌免疫球蛋白、激發非特異性免疫應答、誘導Thl免疫應答并抑制Th2免疫應答等，被認為是一種安全有效的佐劑[35].Blazevic等[36]發現，鼻內接種Ag85B/CpG后，高免疫原性的Ag85B在CpG的輔助下能更多地進入到肺內和黏膜皮下組織，并可以有效防止局部黏膜感染，該疫苗可以兩周內在老鼠的呼吸道內誘導出CD4+Th1和CD8+T細胞。
同時，通過基因工程方法獲得含有內置分子佐劑的新型疫苗在結核疫苗的研發中得到初步應用。如Pepponi等[21]采用基因工程方法在煙草中表達Ag85B-Acr-抗Acr單克隆抗體重鏈（TB-RICS）多肽鏈，該多肽鏈可以通過重鏈自發形成二聚體，純化后的蛋白質經滴鼻免疫后在小鼠體內起保護性作用。這些結核分枝桿菌抗原-重組免疫復合物可以直接結合補體分子，也可以與APC細胞直接結合，從而激發有效的免疫應答。
此外，免疫刺激復合物（immune-stimulatingcomplex, ISCOM）作為另外一種新型疫苗，是蛋白質抗原的脂類載體復合物，通過促進免疫細胞對抗原的攝取，進而促進機體的黏膜免疫應答。An-dersen等[26]研究報道，小鼠接種DNA疫苗時，在佐劑CTA-1DD/ISCOM的幫助下，CD4+T細胞分泌的IFN-γ的水平顯著增加，提高抗結核應答能力。
2.3 黏膜免疫抗原遞送系統
黏膜遞送系統的主要作用是保護抗原，使之免受呼吸道黏膜、胃腸道黏膜或其他部位的酶降解，從而增強機體對抗原的免疫應答。黏膜遞送系統還具有抗原緩釋作用，通過延長抗原的釋放時間、避免突釋效應、維持抗原有效濃度來加強機體產生持續長效的免疫保護作用。目前研究較熱的遞送系統有脂質體、病毒體和病毒樣顆粒、殼聚糖及其衍生物等。
脂質體作為常用的經鼻免疫載體遞送系統，可以增強IgG和局部IgA的應答。Okada等[37]報道與單獨卡介苗的免疫效果相比，Hsp65+IL-12/HVJ-脂質體DNA疫苗能在小鼠和豚鼠體內更迅速地誘導Hsp65特異性的CD8+T細胞，并增強IFN-γ的分泌。病毒體是一種含有功能性病毒膜蛋白的脂質體，例如免疫增強重建流感病毒體（IRIV）[38].病毒體表面通過偶聯抗原，模擬自然感染的途徑，介導多種免疫細胞活化，增強免疫應答。McShane等[39]通過小鼠試驗，發現痘病毒載體疫苗MVA85A能成功增加卡介苗接種后的免疫應答。同樣地，San-tosuosso等[40]報道，腺病毒載體疫苗AdAg85A也能夠增強既有卡介苗的免疫應答。
殼聚糖作為一種新的遞送系統，在經鼻免疫中的作用也不可小覷。殼聚糖有延長疫苗作用時間、維持產物有效濃度、減輕不良反應等優點。Amidi等[41]研究報道，殼聚糖可以通過蛋白激酶C打開細胞間緊密連接，提高黏膜通透性，促進肽類分子的跨黏膜吸收。Bolhassani等[42]報道，以殼聚糖作為蛋白疫苗的遞送系統可以靶向APC細胞，激活CD8+T細胞，產生特異性細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）應答。
基因工程技術的進步也帶動了黏膜遞送系統的研發。通過基因工程方法構建的活重組細菌和病毒載體，具有表達目的抗原、少毒甚至無毒、能增殖和入侵黏膜表面的優點。所以，將活的重組病毒或是細菌作為抗原的遞送系統，既可以提高免疫應答的持久性，也可以獲得免疫效果的多樣性。重組病毒載體目前研究較多，Watanabe等[43]人通過視黃酸Ⅰ型受體誘導基因，用表達Ag85B的重組Ⅱ型人類副流感病毒（rhPIV2-Ag85B）鼻內接種老鼠，可以誘導抗原特異性黏膜免疫應答，免疫效果優于普通的Ag85B免疫應答。
近年來，惰性細菌孢子（inert bacterial pore）作為一種新開發的載體系統，在經鼻免疫中的作用得到較廣泛的研究。Reljic等[3]將表達結核特異性抗原的惰性細菌孢子，鼻內接種小鼠，可以誘導體液和細胞免疫，并誘導產生各種功能的T細胞，能大大減少感染老鼠肺部和脾臟的結核菌落。
還有研究發現，由各種比例的脂類分子和蛋白質組成的脂蛋白所形成的納米顆粒，一方面對抗原有保護作用，同時可以增加黏膜疫苗的有效性。Stylianou等[44]運用肝素結合血凝素黏附蛋白（HBHA）的保護，減少Ag85B抗原在經過肺泡上皮過程中被酶降解的數量，提高了抗原濃度。結果表明，通過鼻內接種表達Ag85B抗原的肝素結合血凝素黏附蛋白（Ag85B-HBHA），能夠誘導小鼠產生持續性的體液免疫應答和CD4+T細胞，增強IFN-γ、IL-2、TNF-α的分泌。
3 展望
抗結核黏膜免疫應答不僅成為抵御結核菌感染的第一道防線，黏膜局部所產生多種免疫效應分子對于激發結核菌感染臟器甚至全身免疫應答都具有重要的免疫調控作用，由此提出的黏膜免疫疫苗也成為結核疫苗研制的新策略。同時，黏膜疫苗接種還具有接種方便，不需要注射器，容易被大眾接受，接種成本低等優勢。通過尋找免疫原性更強的抗原、合適的黏膜疫苗接種途徑、高效的黏膜免疫佐劑和抗原遞送系統，是研發獲得黏膜免疫疫苗的關鍵。在結核黏膜疫苗的研發中，綜合結核抗原的篩選和其他呼吸道感染疫苗研發的最新進展，會使結核黏膜免疫疫苗從實驗室走向實際應用成為現實，為結核病及其他黏膜感染性疾病的防控提供新的手段。
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