細胞因子及其受體廣泛表達于免疫細胞和神經系統,最近 研究發現 細 胞 因 子CCL-2、CX3CL-1、CCL-1等細胞因子可以通過激活脊髓小膠質細胞引起痛覺過敏。近年來,疼痛的表觀遺傳學研究逐步深入。表觀遺傳學是指在DNA序列沒有改變的情況下基因表達發生可遺傳的改變,其中組蛋白乙?；揎検侵匾谋碛^遺傳修飾方式。最新研究發現組蛋白3賴氨酸9位\\(H3histone subunitat lysine residue 9,H3K9\\)乙 酰 化 與 疼 痛 有 關。
CCR-8[chemokine\\(C-C motif\\)receptor 8]作為細胞因子CCL-1的特異性受體,其功能與疼痛調節關系的研究尚未見報道。故本研究擬在小鼠切口痛模型的基礎上,觀察脊髓CCR-8表觀遺傳調控及其對痛覺敏化的影響。
材料與方法
試劑和儀器七氟醚\\(批號:11062431\\),異羥肟酸\\(Sigma公司,美國\\),漆樹酸\\(Sigma公司,美國\\),抗H3K9\\(Sigma公司,美國\\)小鼠一抗、抗CCR-8小鼠一抗\\(Sigma公司,美國\\)和堿性磷酸酶標記馬抗小鼠二抗\\(SC-2034,Santa公司,美國\\),Von Frey纖維絲、Model 400熱痛刺激儀\\(IITC公司,美國\\)。
實驗動物清潔級成年雄性昆明種小鼠64只,體重18~20g,由實驗動物中心提供。所有小鼠實驗前靜養1周,12h/12h晝夜交替,溫度\\(23±1\\)℃,自由進食飲水。實驗動物使用遵守實驗動物倫理的相關規定。
實驗分組64只小鼠隨機均分為:對照組\\(C組\\)、切口痛組\\(INC組\\)、切口痛+組蛋白去乙?；敢种苿┙M\\(INC+SAHA組\\)和切口痛+組蛋白乙酰轉移酶抑制劑組\\(INC+ACA組\\),其中每組10只用于疼痛行為學檢測,每組另外6只于術后第4天檢測脊髓H3K9和CCR-8蛋白表達。
小鼠切口痛模型制備小鼠七氟醚吸入麻醉后,碘伏消毒右后爪跖部,參照文獻介紹的方法制備切口痛模型:使用手術刀片從足底近端向足趾方向縱行切開5mm的條形切口,切開足底皮膚后,用眼科鑷提起足底肌肉并縱向鈍性分離,保持其起止附著點完整。切口處紗布壓迫止血,使用6-0尼龍絲線行褥式縫合,手術后肌注3萬單位青霉素預防感染。
INC+SAHA組和INC+ACA組小鼠分別于術前1d、術前2h及術后連續1~4d每天上午行為學測試后腹腔分別注射50mg/kg的SAHA和5mg/kg的ACA,所有藥物劑量和給藥時間參考文獻和預實驗結果。
小鼠疼痛行為學記錄術前1d\\(T0\\)、2h\\(T1\\)及術后1d\\(T2\\)、2d\\(T3\\)、3d\\(T4\\)、4d\\(T5\\)、5d\\(T6\\)、6d\\(T7\\)、7d\\(T8\\)、14d\\(T9\\)小鼠機械縮足閾值\\(mechani-cal withdrawal threshold,MWT\\)和 熱 縮 足 潛 伏 期\\(paw withdrawal latency,PWL\\)。MWT檢測:將有機玻璃箱置于鐵絲網格上,小鼠置于有機玻璃盒預適應30min,以不同力度的Von Frey纖毛刺激大鼠足底,按照升序的序列從0.2g開始,以纖毛稍稍彎曲作為完全受力標準,持續刺激2s,連續5次,每次至少間隔15s。若3次不抬腿,換高一級克數的纖毛;有3次抬腿,則返回低一級克數的纖毛,直到每5次測試中有3次抬腿。能夠引起3/5次抬腿的最低VonFrey纖毛的克數計為MWT值。
PWL檢測:將有機玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上,小鼠置于有機玻璃盒預適應30min,用熱輻射刺激儀照射小鼠足底,照射開始至小鼠出現抬腿回避終止,熱刺激強度在整個實驗過程中維持一致,自動切斷時間為25s,連續測定5次,每次間隔5分鐘,取后3次平均值計為PWL值。
Western blot檢測小鼠脊髓 H3K9和CCR-8蛋白表達戊巴比妥鈉\\(30mg/kg\\)深麻醉下斷頭處死小鼠,冰上操作取L4~L6脊髓腰骶膨大段,參考文獻 進 行Western blot檢 測 各 組 小 鼠 脊 髓H3K9和CCR-8蛋白表達\\(H3K9和CCR-8一抗濃度為1∶500\\)。所得條帶經Photoshop軟件進行灰度分析,目的蛋白條帶灰度值與相應β-actin灰度值之比反應目的蛋白表達。
統計分析采用SPSS 16.0統計學軟件。計量資料以均數±標準差\\(珚x±s\\)表示。疼痛行為學指標采用雙因素重復測量方差分析,組間兩兩比較采用Bonferroni t檢驗,Western blot數據使用單因素方差分析,組間兩兩比較采用q檢驗。
結果
與T0時比較,T1~T9時C組MWT和PWL比較差異無統計學意義。與C組比較,T2~T7時INC組MWT明 顯 降 低、PWL明 顯 縮 短 \\(P <0.05\\)。與ICN組比較,T5~T8時INC+SAHA組MWT明顯降低、PWL明顯縮短\\(P<0.05\\),T2~T7時INC+ACA組MWT明顯升高、PWL明顯延長\\(P<0.05\\)\\(圖1\\)?！緢D1】
與C組比較,INC組H3K9和CCR-8蛋白表達明顯增加\\(P<0.05\\)。與ICN組比較,INC+SA-HA組H3K9和CCR-8蛋白表達明顯增加 \\(P<0.05\\);INC+ACA組H3K9和CCR-8蛋白表達明顯減少\\(P<0.05\\)\\(表1\\)?！颈?】
討論
外周組織損傷或炎癥產生對傷害性刺激產生過強的反應導致術后痛覺過敏,嚴重影響患者的術后恢復,其機制目前仍不十分清楚。研究發現,小膠質細胞在痛覺敏化過程中其重要作用,其通過趨化因子、促炎細胞因子、炎癥介質等及其受體與神經元發生作用,參與痛覺敏化過程,其中趨化因子在該過程的作用 正 逐 步 受 到 重 視。
CCR-8作 為 趨 化 因 子CCL-1的特異性受體參與痛覺敏化的發展,其功能調節和痛覺敏化關系的研究尚不清楚。
表觀遺傳學是指DNA或周圍染色質修飾,在不改變DNA序列的情況下影響基因的表達。組蛋白尾端賴氨酸共價修飾和DNA甲基化是已知的兩種表觀遺傳調控形式,這種變化趨勢持續存在且與細胞和組織長期適應性改變有關。目前,組蛋白乙?；茄芯孔詈媒M蛋白修飾形式,通過組蛋白乙酰轉移酶\\(Histone acetyltransferases,HATs\\)和組蛋白去乙?；竆\(Histone deacetylases,HDACs\\)調節活性平衡:組蛋白乙?；斐扇旧|松弛,轉錄活性增強;組蛋白去乙?；斐蒁NA卷曲緊密,基因轉錄沉默。組蛋白乙?；腿ヒ阴；徽J為在生理和病理條件下其至關重要的作用,其中包括痛覺敏化過程。藥理學研究顯示,使用HAT或HDAC抑制劑阻斷或刺激組蛋白乙?；捎绊懚喾N疼痛模型的疼痛行為。本研究也發現使用HDAC抑制劑SAHA使小鼠切口痛模型術后第4~7天痛覺過敏增強,HAT抑制劑ACA則可緩解小鼠切口痛模型術后第2~6天痛覺過敏。進一步研究發現腹腔連續注射HDAC抑制劑SAHA后脊髓組蛋白H3K9和CCR-8表達明顯增多,而HAT抑制劑ACA則明顯減少脊髓組蛋白H3K9和CCR-8,這一結果也與疼痛行為學改變一致。
綜上所述,脊髓水平趨化因子受體的表觀遺傳學調控機制在切口痛痛覺敏化過程中發揮重要作用,針對其藥物干預將為臨床切口痛治療提供新的思路。
