EB病毒\\(Epstein-Barr virus,EBV\\)是具有B淋巴細胞嗜性的皰疹病毒,屬皰疹病毒科γ亞科,是重要的DNA致瘤病毒。第一次EB病毒感染大多發生在兒童時期,感染者無明顯臨床癥狀,人一旦被感染將終身帶毒。在一生的任何時期體內病毒若被活化,這種病毒就可能轉變為能引起腫瘤等諸多疾病的病因。研究發現,EB病毒與許多人類惡性腫瘤相關,包括胃癌、霍奇金淋巴瘤、Burkitt's淋巴瘤、鼻咽癌\\(NPC\\)等。
本實驗擬將文獻構建的EB病毒融合基因重組BCG分泌型表達質粒pMV261進行體外及體內的免疫學檢測,評估重組BCG對EBV陽性腫瘤細胞的作用,為應用重組BCG特異性殺傷EBV陽性腫瘤細胞提供理論依據和技術支持。
材料與方法
1 材料
卡介苗\\(BCG\\)分泌型表達質粒pMV261為Sto-ver博士構建;EB融合基因Z2A\\(膜蛋白基因LMP2A與即可早期基因BZLF1融合基因\\)由朱偉博士構建;EB病毒陽性胃癌細胞GT39由羅兵教授饋贈。乳酸脫氫酶底物溶液購于德國Roche公司;非放射性CTL殺傷活性檢測試劑盒、DNA連接酶、DNA聚合酶購于美國Promega公司;EcoRⅠ、DNA Marker、BamHⅠ、SalⅠ為博亞公司產品;T4DNA連接酶、Taq酶及各種限制性內切酶為日本TaKaRa公司產品。
2 方法
2.1 Z2A基因的表達及目的蛋白檢測將重組BCG和普通BCG接種于米氏培養液中,在37 ℃下振蕩培養,測定不同培養時間的吸光度\\(A550\\)值。BCG培養至對數生長期,迅速轉到45 ℃搖床培養,3h后收集菌體,磨砂破碎\\(加溶菌酶\\),以3 500r/min\\(離心半徑10cm\\)離心10min,取上清液,用半透膜濃縮,進行8% SDS-PAGE電泳。取出凝膠,測定蛋白分子質量后電轉移至PVDF膜,PVDF膜用封閉液封閉后進行Western blot。一 抗 為 用 封 閉 液1︰15稀 釋 的 抗BZLF1或LMP2A抗體,二抗為HRP標記物。加入ECL顯色系統顯示,暗室內加X-光片曝光,觀察結果。
2.2 小 鼠 免 疫 與 血 清 抗 體 檢 測將6周 齡 雌 性BALB/c小鼠 隨 機 分 為2個 免 疫 組 和2個 對 照 組\\(BCG對照組和PBS對照組\\),每組5只,每周免疫1次,共3次,間隔3周。其中第1組注射5×108個重組BCG數\\(100μl\\)/只,第2組注射重組BCG 5×107個\\(100μl\\)/只,第3組注射未重組外源片段的BCG 1×108個\\(100μl\\)/只,第4組注射無菌PBS 100μl/只。
免疫前、加強免疫前及末次免疫后每2周小鼠尾部采血,直至免疫后第21周為止。分離血清,采用ELISA檢測特異抗體。包被抗原為LMP2A,每孔0.8μg。底物為四甲基聯苯胺\\(3,3p,5,5p-Tetramethy lbenzi-dine,TMB\\)。用酶標儀測定各孔吸光度\\(A550\\)值。
2.3 細胞毒 T 淋巴細胞\\(CTL\\)反應\\(乳酸脫氫酶法\\)將重組BCG和普通BCG接種于米氏培養液中,在37 ℃下 振 蕩 培 養,測 定 不 同 時 間 的 吸 光 度\\(A550\\)值。
BCG培養至生長中期,迅速轉到45℃搖床培養。在超凈工作臺過濾去除培養基,PBS沖洗2次,收集菌體,用PBS稀釋成細胞數為5×108個/100μl,皮下注射免疫6~8周小鼠,試驗設PBS作對照。第3、5周各加強免疫1次,共免疫3次。7周后殺死小鼠,取脾,制備淋巴細胞懸液,檢測CTL對EB病毒陽性胃癌細胞GT39的殺傷率。
2.4 統計學方法各組數據均以x±s表示,采用SPSS10.0統計軟件作t檢驗。以P<0.05差異有統計學意義。
結果
1 Z2A基因的表達及目的蛋白的檢測
重組BCG用米氏培養基培養后進行破菌,純化的目的蛋白經SDS-PAGE電泳后轉膜,進行Westernblot,結果見 圖1,重 組BCG能同時表達目的蛋 白BZLF1抗體和LMP2A。
2 重組BCG免疫小鼠血清抗體水平
分別用重組BCG 5×108個/只和5×107個/只注射免疫小鼠,采用ELISA方法檢定血清抗體水平,結果見圖2。第一次免疫后2周,高劑量重組RCG免疫組小鼠血清抗體滴度為7 600\\(71.6±8.2\\)pg/ml,低劑量組為5 400\\(54.5±6.2\\)pg/ml,對照BCG及PBS對照株接近于0。隨著免疫時間的延長,重組BCG組刺激機體產生的抗體增長較快,至免疫后第6周,高劑量組抗體滴度達17 600\\(186.5±6.7\\)pg/ml,低劑量組為13 500\\(136±6.2\\)pg/ml,差異有統計學意義\\(P<0.05\\)。
3 免疫小鼠的CTL反應
試驗分重組BCG組、BCG對照組和PBS對照組,每組5只小鼠。CTL反應結果見圖3,重組BCG感染能激發小鼠脾臟CTL反應,其中BCG對照組及PBS對照組對GT39細胞的殺傷率分別為\\(32.5±2.7\\)%和\\(22.8±2.3\\)%,而重組BCG組為\\(62.7±6.2\\)%。其差異具有明顯顯著性\\(P<0.05\\)。其差異具有明顯顯著性\\(P<0.05\\)。
討論
在預防EB病毒感染的多種措施中,接種疫苗是重要手段之一。本研究采用的重組BCG含有EB病毒BZLFl與LMP2A融合基因Z2A,含有pMVZ2A的BCG細胞能同時分泌表達BZLFl與LMP2A蛋白。LMP2A含有能被具有MHC限制性、病毒特異性CTL識別的抗原,能介導CTL發揮作用,是較為理想的靶抗原。對于EB病毒相關腫瘤,LMP2A是免疫治療效果理想的靶抗原。研究發現,體內外所有EB病毒潛伏感染的B細胞中均有LMP2A表達,約50%的EBV相關胃 癌 組 織LMP2A陽 性,而 且LMP2A還是鼻咽癌等腫瘤細胞穩定表達的少數保守抗原,有T細胞激活表位,能介導CTL細胞發揮活性。LMP2A本身是安全的,在腫瘤細胞中能穩定表達,具有潛在的限制性T細胞表位,能誘導殺傷性T細胞,最重要的是表達LMP2A的基因沒有轉化作用,不能導致細胞癌變。Redchenko等曾用負載LMP2A表面多肽的DC免疫誘導強烈的殺傷性T細胞應答。作者前期研究表明,該基因在含EB病毒腫瘤細胞中表達的LMP2A可誘導產生特異性殺傷性T細胞,表達的BZLFI可誘導潛伏期EB病毒進入裂解復制期,從而殺傷含EB病毒腫瘤細胞。BCG被用作減毒活疫苗已有近百年。
BCG作為疫苗載體有以下優點:
1\\)低毒性,很少導致不良反應;2\\)不會影響母體抗體;3\\)較耐熱,是常用的一種疫苗;4\\)BCG接種產生的免疫力可長時間保持;5\\)對實驗動物和人都是較強佐劑,可作用于巨噬細胞和APC,調節Th1型與Th2型細胞的比例。
本研究對重組BCG表達產物進行Western blot分析,顯示BZLFl和LMP2A兩種蛋白均有表達。小鼠體液免疫和細胞免疫試驗結果表明,重組蛋白能刺激機體產生抗體,且重組BCG 5×108個/只免疫組抗體水平高于5×107個/只免疫組。至于是否接種菌數越多抗體含量抗高,有待進一步研究。免疫小鼠的CTL試驗表明,重組BCG感染鼠的脾淋巴細胞可有效激發CTL反應,但效應細胞和目的細胞的比例對其裂解效果影響不大。
以上實驗結果表明,Z2A導入BCG后構建的重組BCG能夠在小鼠體內表達目的蛋白并能有效激發CTL反應,為臨床應用含融合基因的BCG載體預防EB病毒相關腫瘤及結核分枝桿菌感染奠定了基礎。
