哺乳動物個體性別雖在受精時就已決定，但直到胚胎發育到一定階段，具有兩性分化潛能的原始性腺才分化為睪丸或卵巢，而次級性別差異（第二性征）則在性腺分化并獲得內分泌功能（性成熟）后才出現。這一性別決定過程的正常進行有賴于多種性別決定基因的相互作用，如與原始性腺發育有關的SF1、Wilms腫瘤易感基因（WT1），與睪丸發育有關的SRY、SOX9基因，與卵巢發育有關的WNT4、RSPO1基因，等等。它們處在基因調控網絡的上下游，通過相互協同或拮抗而發揮作用。隨著越來越多重要的調節基因被發現，對決定哺乳動物性別的基因調控網絡的認識也在不斷豐富。

一、與原始性腺（雙向分化潛能）發育有關基因

1.SF1:SF1編碼類固醇生成因子-1（SF1），其表達先于Y染色體性別決定基因（SRY），與性腺中支持細胞和間質細胞的形成有關，并介導SRY表達上調[1].

Sf1基因缺失的小鼠性腺及腎上腺均發育不全，性腺的發育在早期未分化階段即停止。故XY小鼠體內Müller管不退化而分化為子宮、輸卵管及陰道上段，使其發生完全性反轉[2].在性腺發育后期，SF1可在睪丸支持細胞和睪丸間質細胞中表達，產物SF1協同SOX9調節抗Müller管激素（AMH）基因及其它性腺發育相關基因的表達水平。有研究表明SF1可協同SRY結合于SOX9的特定序 列，上 調SOX9表 達，產 物SOX9則 取 代SRY,與SF1進一步上調自身基因的表達水平，即SOX9的正 反 饋 調 節[3].在 人 類，SF1突 變 導 致46,XY個體性腺發育不全，還與46,XX個體的原發性卵巢功能不全有關[4].

2.WT1:WT1編碼一類鋅指結構的轉錄因子。

在某些性腺相關的綜合征患者體內可檢測到WT1突變，如WAGR綜合征（Wilms瘤、無虹膜、泌尿生殖器畸形及智力低下）、Denys-Drash綜合征（性腺畸形和腎衰竭）、Frasier綜合征（46,XY個體性腺發育不全）[5].

Wt1突變的小鼠腎臟和性腺不發育，通常在胚胎階段即死于心臟缺陷。

在WT1轉錄的RNA剪切過程中，由于剪切位點不同而導致第3、4鋅指結構間3個氨基酸殘基（KTS,即賴氨酸、蘇氨酸、絲氨酸）的嵌入或缺失，形成+KTS和-KTS兩種WT1蛋白亞型，它們在胚胎形成過程中發揮的作用不同。

-KTS亞型可結合于SRY啟動子而反式激活SRY,也可 結 合 于SF1的啟動子激活SF1表達[6],表明SF1可能是WT1的靶基因。

+KTS亞型的作用可能是調節SRY轉錄水平，另有證據表明該亞型可協同SF1增強Amh基因表達，從而限制Müller管發育[7].

3.LIM同源框基因-9（Lhx9）：Lhx9缺失的小鼠，其胚胎時期原始生殖細胞可正常遷移，但生殖腺嵴中體細胞無法增殖，性腺形成受阻，由于缺乏睪酮和AMH,XY小鼠表型為雌性。研究表明，缺少LHX9的 生 殖 腺 嵴 中Sf1表 達 水 平 極 低，提 示Lhx9可能是Sf1的上游基因[8].體外實驗還顯示LHX9可 協 同WT1結 合 并 反 式 激 活Sf1啟 動子[6].

Gata4敲除的胚胎中，LHX9水平顯著降低，提示Gata4為Lhx9的表達所必需，為Lhx9的上游基因[9].Lhx9在人類早期性腺發育中的作用尚不明確。

4.M33:M33在妊娠第7周即在人類胚胎的生殖腺嵴中表達。在大多數XY小鼠體內，M33基因缺失導致性反轉；在XX小鼠則體現為卵巢的體積減小或缺失。研究發現，M33敲除的XY小鼠，其生殖細胞在胚胎期提早進入減數分裂階段；而雌性突變體減小的卵巢內生殖細胞數目明顯減少且染色體聯會異常的卵母細胞比例增高，提示M33蛋白對雄性生殖細胞減數分裂阻滯、雌性生殖細胞同源染色體正常聯會及染色體穩定性都有重要作用[10].

人類病例中，在1名核型為46,XY,但內外生殖器官的表型均為女性的患者體內檢測到M33編碼區突變。由于M33缺失在兩性都可引起明顯的性腺缺陷，說明M33作用時間在性別決定前的早期性腺發育階段[11],與其表達時間相一致。最近的研究發現，M33缺失的XY小鼠性腺內幾乎檢測不到Sry表達，但若通過轉基因方法使其表達Sry、Sox9則可糾正性反轉，提示M33可能作用于Sry上游調節其表達[12].

5.Insr、Igfr1:Insr和Igfr1分別編碼胰島素受體（INSR）和類胰島素生長因子受體-1（IGFR1）,二者對小鼠腎上腺及生殖器的發育和初級性別決定都是不可或缺的。

INS/IGF信號通路的缺損在原始性腺中導致性別分化之前體細胞的增殖速率下降，同時伴隨數百種性腺發育相關基因的表達下調。

總的來說，缺乏功能性INS/IGF信號的胚胎表現出：（1）腎上腺皮質完全不發育；（2）XY性腺性別反轉；（3）卵巢分化延遲，即XX和XY性腺未分化狀態延長。

Insr/Igfr1雙敲除的XY性腺中，Sry表達水平下降和表達時間延遲導致其下游基因Sox9表達水平也明顯降低，SOX9無法達到使睪丸支持細胞形成所需閾值，進一步導致睪丸間質細胞分化失敗、類固醇無法生成。有研究發現，Sry表達啟動后，初級性索細胞內立刻開始糖原累積，這一能量儲備過程與Sox9上調、睪丸索形成以至睪丸整體發育關系密切，而該過程依賴于INS和IGF,故在Insr/Igfr1雙敲除的XY性腺中，多種糖原合成所需酶類水平均下降，這是睪丸發育缺失的另一原因。

Insr和Igfr1基因雙敲除的XX性腺中，某些卵巢決定因子缺失（如FOXL2）及相關基因表達下降（如Wnt4），與視黃酸合成相關的酶水平也下降（細胞進入減數分裂期需視黃酸誘導），共同導致卵巢分化延遲至胚胎第16.5天（E 16.5）[13].

二、睪丸發育相關基因

1.SRY:SRY是Y染色體上決定雄性性別的基因片段，在性別決定中起開關作用。人類SRY位于Yp11.3.SRY編碼的蛋白質含有DNA結合域（高泳動 類 非 組 蛋 白 盒，HMG-box），該 結 構 域 介 導SRY進入胞核，其非極性蛋白質側鏈嵌入DNA特定區域α-螺旋的小溝與其結合并使之彎曲60°~85°,反式激活所結合的DNA.幾乎所有導致XY個體性反轉的SRY突變都存在于HMG-box內，且HMG-box在哺乳動物種系間具有高度保守性，表明SRY蛋白除HMG-box以外的部分在性別決定中只發揮次要作用，如維持SRY蛋白構象穩定性、促進SRY與DNA的結合等[14].

SRY基因對睪丸發育的啟動有賴于其下游一系列基因的表達。目前確定SRY通過與Sox9的TESCO序列結合反式激活Sox9,故SOX9是SRY的靶基因[15-16].此外，WT1也可能是SRY的靶基因。人類胚胎內SRY在E41開始表達，SRY的表達時間和表達水平關系到其功能的行使，表達過遲將導致睪丸發育不良，表達水平只有達到閾值才能正常誘導睪丸的發育。

2.GATA4和FOG2:Gata4編 碼 的 蛋 白GATA4含有兩個鋅指結構，在識別結合DNA、穩定蛋白質-DNA和蛋白質-蛋白質之間相互作用方面發揮 重 要 作 用。

GATA4與 一 些 蛋 白 質 如SF1,FOG2,WT1等協同作用，調節SRY、SOX9、AMH等性別決定基因的表達[17-18].

實驗顯示，小鼠體內GATA4氨基端鋅指結構突變阻礙了GATA4與FOG2相互作用，導致睪丸發育嚴重畸形[19].在人類，最近的一例家族病例顯示，GATA4雜合型功能缺失性突變導致該家族3名46,XY個體發生性發育疾病，表現為外陰性別不明或陰莖長度縮短。研究發現這一突變蛋白無法結合并激活AMH的啟動子，也無法與FOG2結合發揮協同作用[20].

新的研究發現，Gata4不僅影響睪丸發育，對于生殖腺嵴形成更是不可或缺，它在原始性腺增厚前即在體腔上皮細胞內表達。

Gata4缺陷的小鼠胚胎無法形成原始性腺，體腔上皮仍停留在未分化的單層上皮階段[9].

3.SOX9,SOX8,SOX10:SOX基因家族編碼的轉錄因子均有一保守基序HMG-box,可與DNA序列特異性結合。哺乳動物SRY基因即為該家族成 員，此 外 家 族 中 另3名 成 員，SOX9、SOX8、SOX10,也在XY個體的性腺中表達。

在小鼠胚胎，Sox9起初在兩性生殖腺嵴中低水平表達，但Sry表達后，Sox9在睪丸支持細胞中的表達水平即迅速上升。已證明SRY可啟動SOX9表達，但有實驗表明Sox9可在Sry缺席的情況下啟動轉錄，說明另有激活Sox9表達的途徑。觀察結果顯示含有Dax1無效等位基因或FGF9突變蛋白的小鼠因體內Sox9表達水平下降而導致性反轉，但Sry的表達水平卻與野生型小鼠相仿[21-22],說明DAX1和FGF9可能也有上調Sox9表達的作用。

關于SOX9作 用 的 下 游 靶 基 因，研 究 顯 示SOX9與SF1共同調節Amh基因的表達，前者啟動Amh轉錄，后者主要調節其轉錄水平。體外實驗還發現Sf1在睪丸支持細胞中表達的維持及Vanin-1（Vanin-1編碼泛酰巰基乙胺酶，其產物可保護原始生殖細胞免受氧化應激的傷害）的表達也有賴于SOX9,故這兩種基因也可能是SOX9的靶基因。

動物實驗中，條件敲除Sox9基因的小鼠XY胚胎出現卵巢發育，而過度表達Sox9的XX胚胎出現睪丸發育，說明SOX9的存在及表達水平在性別決定中的重要性[3].人類病例顯示，包含SOX9的序列或SOX9上游序列重復導致XX個體出現睪丸，SOX9上游基因易位導致XY和XX個體的性反轉，SOX9上游序列缺失導致XY個體出現卵巢發育、男性性腺發育不全、外陰性別模糊等癥狀。病例分析顯示，人類SOX9基因的睪丸特有調控元件較小鼠復雜得多[23].雖然SOX9在睪丸發育過程中作用關鍵，但其對睪丸支持細胞的維持和睪丸索的完整 性 似 乎 作 用 甚 微，猜 想 同 族 因 子SOX8及SOX10或可功能性替代SOX9.

小鼠體內Sox8基因于E13.5d時在睪丸索內的睪丸支持細胞中表達。研究顯示，Sox8-/-雄性小鼠生育力降低，提示Sox8對雄性生育力的維持有重要作用。還有實驗表明SOX8可與SF1協同作用，結合于Amh的啟動子激活其轉錄，這支持了在睪丸發育中SOX8和SOX9功能重復這一假設，發生原因可能是兩者來源相同[24].

Sox10基因無效表達的XY小鼠并未觀察到睪丸異常，但其在XX小鼠性腺內的過度表達卻可誘導睪丸發育，顯示Sox10雖不是睪丸發育的必需基因，但仍可作為睪丸決定基因發揮作用[25].此猜想在人類病例中得到支持，46,XX睪丸化患者體內檢測到包含SOX10在內的基因序列重復[26].病因不排除與該重復序列內其它基因有關，但SOX10仍是最有可能的候選致病基因。

4.DMRT1:DMRT1持續在睪丸支持細胞中表達。在人類和小鼠，DMRT1對XY個體出生后睪丸支持細胞和生殖細胞的維持不可或缺。

Dmrt1無效表達的小鼠在胚胎期性腺可正常發育，但在出生后2日即因生殖細胞雌性化而嚴重損害睪丸發育。小鼠睪丸支持細胞中DMRT1缺失使Foxl2表達上調，引起睪丸支持細胞重編程而轉變為顆粒細胞，卵泡膜細胞也隨之形成，這些細胞分泌的雌激素最終導致生殖細胞雌性化[27].相似地，在人類病例中，含有半合子DMRT1基因的46,XY個體表現出睪丸發育不良。但因涉及該基因的病例較少，其對人類睪丸發育的調控機制尚未闡明[28].

5.FGF9:FGF9編碼纖維母細胞生長因子-9（FGF9），在細胞增殖、存活、遷移、分化等不同階段均發揮作用。

Fgf9無效表達的XY小鼠發生性反轉且睪丸支持細胞發育受損。曾經認為發生機制是FGF9缺失時Sox9的表達無法維持，睪丸支持細胞分化異常，導致睪丸無法正常發育，體細胞表達卵巢發育相關基因[22].但最近的研究發現，Fgf9、Sox9、Wnt4之間存在更復雜的相互作用：Fgf9及其受體Fg-fr2缺失的XY小鼠性腺內Wnt4的表達激活，且Fgf9、Wnt4均缺失的XY小鼠睪丸仍可發育，表明FGF9雖可抑制卵巢發育相關信號通路，但對Sox9表達的維持并無直接作用[29].

FGF9作為胚胎睪丸中抑制減數分裂發生的重要蛋白，與減數分裂誘導劑視黃酸（RA）之間存在明顯的拮抗作用。

FGF9直接作用于生殖細胞，通過維持全能性標記物OCT4和SOX2的表達，降低雄性生殖細胞對RA的敏感性[30].

6.Six1&Six4:Six1、Six4基因編碼同源異型蛋白Six1、Six4,兩種蛋白均缺失的XY小鼠性腺發生性反轉并無法激活Sry轉錄，突變性腺中還觀察到前體細胞數目減少及性腺體積減小。

目前認為Six1/Six4有Sf1、Fog2兩個下游靶基因，故對小鼠性腺的影響是由兩個不同的轉錄調控網絡調節的。一方面，Six1/Six4反式激活Sf1,Sf1在Sry表達啟動前參與調控性腺中前體細胞的生長，故可決定性腺體積；另一方面，Six1/Six4反式激活Fog2,FOG2可與GATA4共同上調Sry表達，故與雄性性腺分化有關[31-32].

7.MAP3 K1、MAP3 K4:近年促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在人類和小鼠性別決定中的作用逐漸引起重視。一些病例中MAP3 K1的突變改變其下游靶分子的磷酸化水平，最終使46,XY患者表 現 為 部 分 或 全 部 性 腺 發 育 不 全。同 族 基 因MAP3 K4也被發現與性別決定相關。研究發現，在Map3k4的編碼區可發生byg突變（一種無 義突變），使酪氨酸受體激酶結構域發生區域截斷。在byg突變純合子小鼠體內，Sry表達明顯下降，睪丸特有的細胞活動，如體腔上皮細胞增殖、中腎細胞遷移等均受到損害，相反，卵巢促進基因的表達卻被上調，最終導致XY小鼠的性反轉[33].

8.Gadd45g:生長抑制和DNA損傷誘導45G蛋白 （Gadd45G）是 所 屬 蛋 白 家 族 中 唯 一 能 調 節SRY水平的蛋白質。

Gadd45g在雌雄兩性的早期性腺中表達水平相似，但在11.5dpc這一性別分化的關鍵時間在XY性腺中表達水平達到頂峰。在不同基因背景中，Gadd45g缺陷的XY小鼠表現出從不育至雌雄間性表型等不同程度的DSD或發生完全性反轉[34].該現象的分子機制是Sry表達的級聯反應---MAP3K4和GADD45G在MAPK通路中起到轉換信號的作用，使GATA4磷酸化而激活，活化的GATA4與Sry的啟動子結合并激活其轉錄，從而啟動男性性別決定過程。當Gadd45g基因缺陷時，這一通路被抑制，最終使Sry表達被破壞，導致卵巢和Müller管發育[35].

雖然至今未有人類Gadd45g-/-個體的報道，但Gadd45g-/-小鼠 表 現 出 的 完 全 性 反 轉 以 及Gadd45g是Sry上 游 激 活 因 子 的 事 實 都 提 示Gadd45g可能是人類無綜合癥候的男性不育和46,XY個體部分或全部性反轉的致病基因。

三、卵巢發育相關基因

1.WNT4:Wnt4于E9.5在兩性胚胎中表達，E11.5時，Wnt4在男性性腺中表達下調，在女性性腺及Müller管周圍間質中的表達仍維持?？芍谠夹韵匐A段，Wnt4與雌雄胚胎Müller管形成有關[36].Wnt4-/-XX小鼠表現出部分性反轉，這些突變小鼠的性腺形態類似睪丸，但不形成睪丸索或表達睪丸支持細胞特有標記；Müller管消失而Wolff管繼續發育。攜帶WNT4突變的患者癥狀與突變小鼠表型類似[37].說明該基因可抑制男性特有的脈管系統在卵巢內形成，可能是通過抑制Sox9表達上調實現的。但功能獲得性實驗發現，異位表達Wnt4的雄性小鼠仍可形成雄性體腔脈管（形態和分支存在畸形），表明WNT4并非卵巢內唯一抑制男性脈管系統形成的因子或睪丸可表達某種對抗WNT4抑制作用的因子[38].

2.RSPO1:Rspo1敲除的XX小鼠形成雄性化性腺，但不表現為完全的性反轉，這與Wnt4無效表達的XX小鼠的表型相似，提示二者作用于同一信號通路（激活β-連環蛋白）[39].進一步研究發現，在Rspo1-/-的XX小鼠性腺內，Wnt4的表達水平降低，經典Wnt信號通路無法激活，表明RSPO1是Wnt4上游的正調節因子，其編碼的分泌因子可維持β-連環蛋白的穩定[40].

目前已在多例46,XX睪丸性患者體內檢測到RSPO1突變，表明RSPO1也是人類卵巢發育中的關鍵基因。

RSPO1和WNT4都可促進卵巢發育而抑制睪丸發育，在46,XY性腺發育不良患者體內檢測到染色體1p上含有RSPO1和WNT4的片段重復可支持這一事實。

3.FOXL2:對Foxl2基因敲除、Wnt4基因敲除、Foxl2和Wnt4基因雙敲除三種小鼠的研究顯示，Foxl2和Wnt4基因雙敲除的XX小鼠表現出睪丸分化和男性生殖細胞發育，說明Foxl2基因對顆粒細胞的形成必不可少[41].此外，對成年XX小鼠進行Foxl2基因條件敲除，發現其卵巢轉分化為睪丸，卵巢結構、導管形態及體細胞均表現出男性化特征，分子水平上Sox9等睪丸分化相關基因的表達上調[42].該結果表明即使在成年時期，Foxl2仍對卵巢形態和功能的維持起到重要作用。在人類，FOXL2突變通常與BPES綜合征有關，患者常伴有卵巢機能障礙（如卵巢早衰等）[43].最近的研究發現，Foxl2敲除的小鼠體內Sf1表達水平遠高于正常小鼠，且該表達水平的改變與上游調控分子WT1、LHX9無關；進一步的實驗證明，FOXL2通 過 直 接 與Sf1啟 動 子 的 特 定 位 點1結合而抑制Sf1的表達[44].哺乳動物的性別決定是眾多基因參與的復雜程序，某一基因的功能喪失或表達失控，都將對其他基因產生重大影響，導致兩性發育異常。雖然目前對性別調控機制有了一定程度的認識，但這種認識并不系統完整。隨著生命科學的不斷發展，哺乳動物的性別決定機制這個謎團將逐步被解開，這將為多種人類性發育疾病的治療帶來光明。