現代許多臨床研究已表明,人類血小板抗原\\(HPA\\)所導致的血小板同種免疫與新生兒同種免疫性血小板減少癥 \\( NATP\\)、血 小 板 輸 注 無 效\\(PRT\\)、輸血后紫癜\\(PTP\\)、移植相關血小板減少癥、動脈血栓性疾病等相關[1,2].而不同人群中的HPA 抗原的分布頻率是與獲得 HPA 免疫機會正相關的,本文選擇云南省獨有的阿昌族為研究對象,與云南漢族為對照,采用目前 HPA 基因分型最常用的PCR-SSP 技術,對不同人群中 HPA 基因及基因型頻率的分布情況作對比分析,探討血小板抗原多態性與地區、民族的關系,建立云南少數民族地區的血液資源的血小板基因資料庫,同時有助于探討少數民族的起源、遺傳、遷移及為法醫個體識別提供數據.
1 對象與方法
1. 1 研究對象 2011 ~ 2012 年,采集分布在滇南地區的阿昌族健康人群 139 例,昆明地區健康漢族人群 150 例,所有樣本追溯三代無與其他民族通婚史,彼此間無血緣關系,對所有選取對象均履行倫理知情告知,并自愿參加.
1. 2 標本 每人抽取 EDTA-K2 抗凝靜脈血 2 ~ 3ml,- 80℃ 凍存待檢.
1. 3 儀器與試劑 PCR 擴增儀、水平電泳儀:美國Bio-Rad 公司,凝膠成像系統:Bio-Rad 公司 Gel DocEQ 凝膠成像系統.血小板抗原基因分型試劑盒:長春博德生物技術有限公司.
1. 4 DNA 提取 采用碘化鉀法,用紫外分光光度計測定提取的基因組 DNA 的紫外吸收峰,分別在波長 260 nm、280 nm 測定吸光度,用公式計算 DNA 濃度、純度.統一稀釋成 1 μg/μl 于 -20℃儲存.
1. 5 HPA 基因分型試驗 包括 PCR 引物混合物\\(序列特異性引物 0. 4 μmol/L,內對照引物 0. 4μmol/L\\)、10 × PCR Buffer 5μl、dNTP 0. 2 mmol/L,Taq 酶 0. 75 U 和基因組 DNA 1 μg,在同一條件下對HPA1 ~ 17 系統同時進行 PCR 擴增.PCR 反應條件: 94℃、9 min; 94℃、1 min; 61℃、1 min;72℃、1min;共 35 個循環;最后 72℃,10 min.
1. 6 擴增產物的檢測 PCR 產物 10 μl 在 2% 瓊脂糖凝膠\\(含 0. 5 mg/L 溴化乙錠\\)中電泳,80 mV 電壓,30 min 結束電泳,凝膠成像系統觀察并記錄結果.
1. 7 統計學處理 采用 SAS9. 3 統計軟件,進行 χ2檢驗.不同人群間基因頻率的比較進行 χ2檢驗\\(精確概率法\\),基因型之間的比較采用χ2檢驗的多個構成比的比較.以 P < 0. 05 為有差異,P < 0. 01 為有顯著性差異.
2 結果
2. 1 阿昌族 HPA1 ~ 17 系統基因檢測及統計結果139 例阿昌族人群 HPA1-17 系統基因檢測結果見表1,圖1 為阿昌族人群 HPA1 ~17 系統基因分型的凝膠成像圖:阿昌族人群中 HPA-7、HPA9 ~ 14,HPA-16 抗原系統的基因型均為 aa,未檢測出相應的等位基因 HPA-b;HPA-1,2,4,5,6,8,17 抗原系統的基因型以 aa 居多,HPA-3,15 具有較高的雜合度,HPA-3aa、3ab、3bb 的基因型頻率分別為 31. 65% 、48. 2% 、20. 15%,HPA-15aa、15ab、15bb 的基因型頻率分別為 35. 25%、36. 69%、28. 06%.經 χ2檢驗,阿昌族人群樣本的基因檢測結果符合 H-W 遺傳平衡定律.
2. 2 漢族組人群 HPA1 ~ 17 系統基因和基因型頻率分布 150 例漢族人群中 HPA7 ~14,HPA16,17 抗原系統的基因型均為 aa,未檢測出相應的等位基因HPA-b;HPA1,2,4,5,6 抗原系統的基因型以 aa 居多,HPA3,15 具有較高的相同的雜合度,其 aa、ab、bb 的基因型頻率分別為 34% 、46. 67% 、19. 33% ,結果見表 2.
2. 3 阿昌族與漢族人群間基因頻率的比較 兩個民族的 HPA-7,HPA9 ~ 13,HPA-14,16 系統的基因型均為 aa,均未檢測出相應的等位基因 HPA-b;兩個民族的 HPA-3 與 HPA-15 均具有較高的多態性;與對照組\\(漢族\\)人群比較,阿昌族 HPA-1a 系統有差異\\(P <0. 05\\),結果見表 3.
3 討論
現代許多臨床研究已表明,人類血小板抗原\\(HPA\\)所導致的血小板同種免疫與新生兒同種免疫性血小板減少癥 \\( NATP\\)、血 小 板 輸 注 無 效\\(PRT\\)、輸血后紫癜\\(PTP\\)、移植相關血小板減少癥、動脈血栓性疾病等相關、對此類疾病的診斷、預防和治療均需以血小板同種抗原的基因分型為基礎.
云南省匯集了全國最多的少數民族,少數民族間進行血液輸注的可能性非常大,故非常有必要進行其他少數民族 HPA 基因多態性的研究,特別近年來部分少數民族人口數量下降,對于保存其民族遺傳學和人類學資料也具有重要意義;目前國內外對HPA 研究可見報道,其中,國內目前對漢族人群的HPA 研究較多[3,4],少數民族 HPA 研究報道甚少[5,6],而云南省少數民族血小板同種抗原的研究尚未見報道[7].
本文以云南省特有的少數民族阿昌族為研究對象,對不同人群中 HPA 基因及基因型頻率的分布情況作對比分析,探討血小板抗原多態性與地區、民族的關系,研究結果顯示:從 HPA 基因分型結果可看出\\(見表 1 ~ 3\\),云南地區阿昌族健康人群中的HPA1 ~ 17 基因頻率與同地區的漢族接近,也呈現各自自身的特點.兩個民族的 HPA-7、HPA9 ~ 13、HPA-14,16 系統的基因型均為 aa,均未檢測出相應的等位基因 HPA-b;兩個民族群樣本的 HPA1 ~ 6、HPA-8,13,15,17 系統中 a 的基因頻率均大于50%;阿昌族與漢族人群的 HPA-3 與 HPA-15 系統均具有較高的多態性,明顯較其他系統具有較高遺傳多態性,通過對 MP 值的計算發現,HPA-3、15 系統易發生因為錯配輸注產生同種免疫反應.阿昌族HPA-1a 基因頻率與漢族人群相比差異有統計學意義.因此,為提高血小板輸注的安全性和有效性,應高度重視 HPA 同種免疫作用,同時關注是否存在不同民族之間血小板抗原基因差異而導致的免疫作用.根據本次調查的 HPA 基因多態性頻率,可以預測阿昌族人群發生血小板同種免疫的風險,在臨床上,HPA-1a、HPA-3 與 HPA-15 為具有重要意義的血小板抗原系統.對少數民族進行 HPA 分型,可對預防和診斷由 HPA 同種免疫所造成的疾病,建立少數民族地區血小板供者庫提供依據.HPA 作為人類遺傳多態性標記,還可應用于法醫個體識別,人類進化與遷徙,以及某些疾病相關性的研究.
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