γ - 干擾素是由 T 淋巴細胞和自然殺傷細胞產生的具有免疫效應的分子,在內含子區 + 874 和+ 2109存在兩個調控基因轉錄的多態性.在中國人群中發現,+874A 等位基因和與 +2109G 構成的單倍型 AG 在 HBV 感染者中的頻率顯著高于正常人群,提示這個單倍型人群具有較高的 HBV 感染風險[1].乙肝病毒攜帶者及部分乙肝患者的臨床癥狀不明顯,而忽視了對該類人群預防.遺傳因素可能在藏區人群 HBV 感染率高方面起了重要作用,有人推測可能是通過影響相關的免疫應答反應而導致高感染 率[2].本 課 題 就 青 海 地 區 藏 族 人 群 中IFN - γ基因的 2 個多態性基因位點與慢性乙肝易感性之間的關系開展相關研究.
1 材料與方法
1. 1 研究對象
乙型肝炎組 250 例,為 2012 年 6 月 ~2012 年 9月期間在青海省傳染病醫院確診的藏族乙型肝炎患者\\( 乙型肝炎組\\) .對照組 134 例\\( 正常對照組\\) ,來源于同一所醫院的健康體檢者.抽取靜脈血 5 mL,EDTA - K2 抗凝,分裝,- 80 ℃ 低溫保存.
1. 2 研究方法
1. 2. 1 DNA 抽提
基因組 DNA 提取用北京康為世紀基因組小量抽提試劑盒.
1. 2. 2 目的片段擴增
使用 iPLEX GOLD \\( Sequenom MassARRAY\ue4d2\\)對 PCR 引物進行設計\\( 見表 1\\) .
1. 2. 3 目的基因片段獲取
按照 iPLEX GOLD 建議的 PCR 條件進行單堿基擴增,然后經過 SAP 消化、單堿基延伸,得到目的基因片段.
1. 2. 4 電泳、洗滌
根據 PCR 片段配置 1% 瓊脂糖凝膠,用微量進樣器將樣品依次加入到膠孔中,120 v 條件下恒溫電泳 10 h.取出樣品,卸膠,放入 70% 乙醇中搖床固定 15 min,蒸餾水沖洗兩遍.
1. 2. 5 飛行質譜表型分析
PCR 的產物在單個堿基延伸后將純化的 DNA收集后采用時間飛行質譜技術進行表型分析.
1. 2. 6 統計學處理
用 SPSS17. 0 軟件完成,考察 Hardy - Weinberg平衡以判斷樣本的代表性.實驗數據中所有計量資料用算術平均值 ± 標準差表示,乙型肝炎組與正常對照組之間等位基因與基因型分布差異顯著性檢驗采用 χ2檢驗,檢驗水準 α =0. 05.
2 結果
2. 1 IFN - γ + 2109C / T 位點
2. 1. 1 IFN - γ + 2109C / T 位點各基因型及等位基因頻率的比較采用飛行質譜法檢定 IFN - γ + 2109C/T 位點的基因型,結果見圖 1.兩組共檢測 384 例患者,各基因型及等位基因頻率\\( 見表 2\\) .
2. 1. 2 IFN - γ + 2109C / T 各組間基因型和等位基因分布頻率的比較2. 2 IFN - γ + 874A / T 位點2. 2. 1 IFN - γ + 874A / T 位點各基因型及等位基因頻率采用飛行質譜方法能有效地檢定 IFN - γ +874A / T 位點的基因型,見圖 2.兩組共檢測 384 例患者,各基因型及等位基因頻率\\( 見表 3\\) .
2. 2. 2 兩組共檢測 384 例患者,各基因型及等位基 因頻率\\( 見表 3\\) .
2. 3 基因型頻率 Hardy - Weinberg 平衡檢驗將本實驗所測實際值與預測值比較,經卡方檢驗,正常對照組與乙型肝炎組符合 Hardy - Weinberg平衡檢驗\\( P > 0. 05\\) ,證明研究對象符合遺傳平衡法則.
3 討論
本研究結果顯示,IFN - γ +874、IFN - γ +2109基因位點多態性與青海地區藏族人群 HBV 感染的易感性可能無關; IFN - γ + 874 的等位基因 T 可能是一個保護性基因.
青海藏族人群是乙肝高發區,青海本地藏族人群的 HBV 攜帶及乙肝發病率明顯高于全國水平[3].
大部分感染者在病程發展中均能清除病毒,僅有8% 左右的感染者演變為慢性肝炎.但是 HBV 病毒持續存在的原因目前尚不明確,即使在同一種族、年齡及性別相似的機體中,使用同一種方法感染相同的病毒亞型,也會產生不一樣的后果,因此研究表明,遺傳基因在 HBV 感染過程中起著很重要的[4].
IFN - γ 又叫Ⅱ型干擾素,IFN - γ 基因與免疫應答機制的啟動和調節關系密切.研究已證實IFN - γ參與 HBV 病毒清除和機體免疫應答過程,其基因的多態性是否與青海地區藏族人群 HBV 感染的易感性有關,值得進一步探討.
本研究結果經過證實 IFN - γ + 874 與 IFN - γ+ 2109 各位點與乙型病毒性肝炎易感性未見明顯相關性.結果表明,+ 874 和 + 2109 位點在乙肝和正常對照組之間各基因型在各組間的分布頻率比較均未發現有顯著性意義.但是在實驗結果中發現 +874 等位基因 T 在病例組和對照組基因頻率分別為81. 6% 和 87. 7% ,對照組的基因頻率高于病例組,表明等位基因 T 可能與乙肝患者的保護性有關.
此結果與 cheong 等[5]的研究結果一致,提示INF - γ 的基因位點可能與 HBV 感染以及發生發展過程中沒有明確聯系.本研究結果與 Ben - Ari等[6]的結果不一致,發現在慢性 HBV 攜帶者和健康者中內含子 +874 位點單核苷酸多態性分布有顯著性差異,并且這一差異可能與 IFN - γ 產物水平高低有關,大多數患者比健康者產生的 IFN - γ 要少.本研究顯示青海地區藏族 IFN - γ + 874 和+ 2109基因位點多態性在青海地區藏族人群 HBV及健康者中分布差異均無統計學意義. + 874 和+ 2109位點突變型基因能否影響 IFN - γ 產物表達,需要進一步證實.實驗結果同時表明,青海地區正常藏族人群 IFN - γ + 874 等位基因 T 的頻率高于青海藏族 HBV 人群,這暗示著藏族 IFN - γ +874等位基因 T 可能對乙肝具有保護性.由于基因間存在復雜的交互作用,所以單個等位基因變化不會是保護或者易感因素,幾個 SNP 位點或者單體型的聯合作用可能會成為 HBV 感染的易感因素.本研究對 IFN - γ 基因 + 874 和 + 2109 位點進行單倍型分析,連鎖遺傳的兩種單體型 CT 和 AT 在病例組和對照組間無統計學差異,尚不能說明其與青海地區藏族人群 HBV 易感性有關.
青海地區藏族人群不同的生活方式,可能對其HBV 的高感染率有一定影響[7].本文對青海地區藏族人群 IFN - γ 基因啟動子 + 874 和 + 2109 基因位點多態性與 HBV 易感性的研究結果也許受到多方面因素的影響.本實驗結果沒有顯示此位點與乙肝易感性有著明確的相關性,因此我們對藏族群體的乙型病毒性肝炎易感性的特異性研究還有待進一步的深入,出現這種陰性結果的原因可能與樣本的樣本量少有關,需要進一步驗證結果.
進一步查找 IFN - γ 對藏族 HBV 感染的易感基因型及單倍型對乙型肝炎病毒感染的預防有重要意義[8],對積累藏族群體免疫遺傳學資料及了解其遺傳多樣性也具有重要的作用.
參考文獻
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