不同程度放射性肺損傷是胸部腫瘤放射治療后常 見的并發癥，限制了胸部腫瘤放療劑量提升致腫瘤控制率下降，同時嚴重影響患者生存質量[1],嚴重者成為非腫瘤致死因素。盡管近年來放療設備不斷更新及放射技術不斷完善，但放射性肺損傷發生率仍然較高[2-3]且缺乏有效治療措施，因此放射性肺損傷一直成為研究的焦點之一。本研究擬采用單次大劑量和分次照射大鼠雙肺，通過比較照射后肺組織動態病理變化、肺組織 TGF-β1 表達、血清 TGF-β1 含量測定，為研究放射性肺損傷提供可靠的大鼠動物模型。
1 材料與方法
1. 1 實驗動物及分組
健康 SD 大鼠 85 只，照射前后均飼養于江西中醫藥大學教育部重點實驗室，隨機抽簽分為對照組 15 只（ A 組） 、單次照射組 35 只（ B 組） 、分次照射組 35 只（ C 組） .
1. 2 照射方法
速眠新Ⅱ1 ml 肌肉（ 腹腔） 全身麻醉后，5 只大鼠并排仰臥固定于自制老鼠板上，在 X 線模擬機下確定照射野（ 雙肺照射） : 上界為肺尖，下界為肋膈角，左右漏空，射野大小一般為 4. 5 cm × 20 cm.采用西門子Primus 高能直線加速器 6MV X 線進行垂直照射，放置2 cm 厚補償膜，源皮距 100 cm,深度 3. 5 cm,劑量率 3Gy / min,A 組大鼠麻醉后佯裝照射，B 組大鼠單次照射（ 15 Gy） ,C 組大鼠分次照射（ 3 Gy/次，2 次/周 × 3周） .
1. 3 取材及處理
于照射后第 1、3、5、8、12 周末 5 個時相點隨機活殺 A 組大鼠3 只、B 組及 C 組大鼠各7 只，經股動脈留取大鼠血液 3 ~ 5 ml,4 ℃下靜置待凝固后 3 500 轉/分，離心 5 min 取上清貯存于 -70 ℃冰柜內備用。剖開胸腔分離主支氣管，快速將氣管及雙肺剝離出胸腔，觀察肺的大體結構改變。選取右肺中葉組織用 10%甲醛固定，常規石蠟包埋，5 μm 連續切片，HE 常規染色比較觀察各組肺組織病理組織結構改變。采用免疫組化法檢測肺組織 TGF-β1 表達。
1. 4 免疫組化結果判斷標準
陰性（ -） : 胞質中無顆粒沉著； 弱陽性（ + ） : 胞質中淡黃色細顆粒沉著； 陽性（ + + ） : 胞質中棕黃色顆粒沉著； 強陽性（ + + + ） : 胞質中褐黃色粗顆粒沉著。
陰性和弱陽性歸為陰性結果； 陽性和強陽性歸為陽性結果。
1. 5 血清 TGF-β1 含量測定
備用大鼠血清在室溫下融化后 2 h 內采用 ELISA法測量 TGF-β1 含量（ ng/ml） ,測量試劑盒由美國 ADL公司生產，操作步驟嚴格按說明書要求進行。
1. 6 統計軟件和方法
應用 SPSS 15. 0 統計軟件進行分析，組間陽性率計數資料比較采用配對 χ2檢驗，P <0. 05 時被認為有統計學意義。
2 結果
實驗期間，共有 8 只大鼠死亡，其中 A 組無死亡，B 組 7 只，C 組 1 只，最早死亡發生在照射后 3 周，死亡集中在 3 ~8 周之間，死亡大鼠同樣取右中肺組織。
B 組大鼠在照射后精神差、活動少、體重下降，C 組大鼠照射后在精神、活動及體重方面與照射前變化不明顯。
2. 1 肺大體標本觀察
各時間點 A 組大鼠肺表面均光滑，呈粉紅色，彈性良好。B 組、C 組大鼠于照射后第 1 周肺組織稍有腫脹，表面見少量散在點狀出血； B 組、C 組大鼠分別于照射第 3 周、5 周后肺的顏色由鮮紅色逐漸變為暗紅色，顏色進行性加深，且肺組織有腫脹。B 組大鼠照射后第 8 周、第 12 周肺體積明顯縮小，表面呈灰白色，可見凹凸不平結節，質地硬，彈性明顯降低，而 C 組大鼠于照射后第 12 周出現上述外觀改變。
2. 2 HE 染色組織學觀察
A 組大鼠肺組織結構清晰，肺泡壁薄而光滑，血管正常，肺泡腔完整，腔內無滲出物。B 組大鼠照射后第1、3 周及 C 組大鼠照射后第 3、5 周可見肺泡充氣不良，肺泡壁輕度水腫，毛細血管充血，肺泡腔內可見少量滲出及較多中性粒細胞浸潤，間隔無明顯滲出、充血和水腫。B 組大鼠照射后第 3、5 周及 C 組大鼠照射后第 5、8 周可見肺泡間隔增寬，肺泡間隔及部分肺泡腔內可見纖維素樣的滲出物及大量單核巨噬細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤，肺組織中可見散在的體積縮小變圓、胞質紅染、胞核固縮藍染似凋亡的細胞，與壞死的細胞較難區別。B 組大鼠照射后第 8、12 周可見肺泡間隔進一步增寬，肺泡間隔破壞，可見到由梭形成纖維細胞構成的成纖維病灶，膠原纖維呈帶狀，大部分肺泡腔塌陷、不張。肺內病變輕重不一，可見肺實變，C組大鼠僅于照射后第 12 周出現上述改變。
2. 3 各組大鼠血清 TGF-β1 含量比較
A 組大鼠血清 TGF-β1 含量在各時相點平穩，B 組及 C 組大鼠血清 TGF-β1 含量依順序時相點持續升高，于第 12 周達峰值，均顯著高于 A 組（ P <0. 05） ,B組稍高于 C 組，比較無差異（ 圖 1） .
2. 4 各組大鼠肺組織 TGF-β1 免疫組化結果比較
A 組大鼠肺組織 TGF-β1 表達分別在第 3 周及第8 周出現 1 只陽性。而 B 組及 C 組各時相點大鼠肺組織 TGF-β1 表達陽性表達數目從第 1 周至第 12 周均呈上升趨勢（ 圖2） .A 組與 B 組及 C 組大鼠肺組織各時相點 TGF-β1 表達陽性率比較均有顯著性差異（ 表1） ,B 組與 C 組大鼠肺組織各時相點 TGF-β1 表達陽性率比較，差異無顯著性?！?】
3 討論
放射性肺損傷是胸部腫瘤放射治療常見的并發癥，是影響患者放療的主要劑量限制性因素[4],目前臨床上缺乏有效的防治措施，因此放射性肺損傷防治研究是醫學研究的熱點領域之一。成功建立動物放射性肺損傷模型是研究防治放射性肺損傷關鍵的第一步，陸忠華等[5]在建立小鼠放射性肺損傷模型研究中，以肺大體標本變化、染色組織學檢查及肺組織TGF-β1 含量等作為鑒定指標，成功復制出了典型的放射性肺損傷小鼠動物模型。
另外不乏建立放射性肺損傷模型的研究[6-8],但鮮有采用與臨床放射治療相似的分次分割照射方式建立放射性肺損傷模型的研究。本研究試圖以兩種分割方式照射大鼠雙肺建立放射性肺損傷動物模型，合理評估兩種分割照射方式建立放射性肺損傷動物模型的可行性、科學性及實用性。
本研究中，在照射大鼠雙肺后，以肺大體標本變化、HE 染色組織學檢查及肺組織 TGF-β1 表達、血清TGF-β1 含量進行放射性肺損傷的鑒定。結果顯示，通過大體標本觀察及 HE 染色組織學檢查，單次照射組和分次照射組大鼠肺組織學改變均經歷一個不能完全分開的連續過程，分別為急性炎癥期（ 肺泡壁水腫，毛細血管充血，肺泡腔內可見滲出液） 、增生期（ 肺泡間隔增寬，肺泡間隔及部分肺泡腔內見纖維素樣滲出物及單核巨噬細胞） 及纖維化期（ 肺泡間隔進一步增寬并破壞，見由梭形成纖維細胞構成的成纖維病灶，膠原纖維呈帶狀，肺泡塌陷、不張） ,與國內外[9-10]研究得出的放射性肺損傷病變規律和特點一致。TGF-β1 廣泛存在機體各組織中，可抑制實質細胞的增值，促進纖維母細胞和成骨細胞增值，刺激細胞增加基質合成、減少基質降解[11].動物試驗和臨床觀察資料提示胸部腫瘤放療后 TGF-β1 的變化和放射性損傷的發生明顯相關，均證明 TGF-β1 在放射性損傷發生發展過程中起著重要作用[12-13].故通過檢測肺組織 TGF-β1 表達水平及其血清含量可反映放射性肺損傷的發生及程度。
本研究結果顯示，B 組和 C 組大鼠雙肺照射后，肺組織TGF-β1 陽性表達率及血清 TGF-β1 含量依順序時相點逐漸升高，于第 12 周達到最高峰，與 A 組各相應時相點結果比較有顯著差異，單次照射組稍高于分次照射組，比較無差異。且血清 TGF-β1 含量絕對數值與各時相點放射性肺損傷嚴重程度相對應。病理免疫組化和 TGF-β1 檢測結果均提示單次照射方式和分次照射方式均成功建立了放射性肺損傷動物模型。
對放射性肺損傷穩定性進行分析，分次照射組、對照組存活率分別為 97% （ 34/35） 、100%,明顯高于單次照射組存活率（ 80%） ,分次照射建立的放射性肺損傷動物模型利于較為長期的實驗觀察，對實驗結果影響小。
綜上所述，單次及分次照射大鼠肺組織均能建立可靠的放射性肺損傷動物模型，符合病變規律及特點。
大鼠全肺照射野容易控制，單次照射簡單，不影響臨床工作，可用于短期試驗研究； 分次照射更符合臨床放療常規分割，死亡率低，可行性良好，分次照射利于長期試驗研究。
