血管內皮細胞具有產生和分泌多種生物活性物質、調節血管舒縮、抗凝血、維持血管內穩態等多種生理功能。內皮細胞在血栓與止血、血管新生、炎癥及免疫反應等一系列病理過程中也起著關鍵的作用。隨著人們對心腦血管疾病研究的深入，血管內皮細胞的許多功能被不斷發現和重新認識。由于高血壓、動脈粥樣硬化、心腦血管梗塞、腫瘤等疾病的增加，引起人們對血管性疾病的病因、發病機制、發生發展過程等給予更多地關注。血管內皮細胞是研究血管功能和心血管疾病重要的工具之一，而血管內皮細胞的分離和體外培養是研究其功能的基礎。
血管內皮細胞通常從其形態學特征、CD31 表達等方面進行鑒定。目前，大多數學者選用臍靜脈分離內皮細胞\\( human umbilical vein endothelial cells，HUVEC\\)作為研究模型，國內外均未見有分離人動脈內皮細胞方法的報道。因為具有活性的人源動脈十分稀有、不易獲得且取材有一定難度，所以對動脈系統特別是動脈內皮的研究多用大鼠、豬或牛的動脈細胞來替代，也有學者使用人主動脈內皮細胞進行分析研究，多數為購入的商品化細胞，受人體材料來源的限制，價格十分昂貴。灌流消化法是利用健康產婦正常分娩的胎盤臍帶分離臍動脈內皮細胞\\( human umbilical arterial endothelial cells，HUAEC\\) ，取材容易，方法可靠，操作簡便，細胞成功傳代培養并鑒定。
1 材料和方法
1． 1 材料
1． 1． 1 主要試劑和儀器 HepG2 人肝癌細胞為北京大學生命科學學院顧軍教授惠贈，人胚腎 293A 細胞系為北京大學分子醫學研究所朱曉君老師惠贈，M199 培養基、胎牛血清購自 Gibco 公司，1 型膠原酶購自 Worthington 公司，成纖維細胞生長因子購自 Peprotech 公司，肝素鈉、青霉素、鏈霉素和化學試劑購自 Sigma 公司，鼠尾膠原、Matrigel 膠、小鼠抗人CD31 抗體購自 BD 公司，小鼠 IgG、熒光標記的山羊抗小鼠IgG 抗體購自中山金橋公司，S100 倒置相差顯微鏡購自日本Nikon 公司，IX2-SP 熒光顯微鏡購自日本 Olympus 公司，小鼠灌胃針頭購自蘇州市蘇杭實驗動物設備廠。
1． 1． 2 標本收集 無菌條件下分離正常妊娠足月分娩的新生兒臍帶\\( 北京海淀婦幼保健院產科，孕婦產前檢查 HBsAg、衣原體、人免疫缺陷病毒及梅毒均陰性\\) ，低溫 4℃保存在含青、鏈霉素的 PBS 中，6 h 內完成分離細胞的操作。本項研究經北京市海淀婦幼保健院科教科及北京大學倫理委員會批準，產婦知情并志愿捐獻。
1． 2 方法
1． 2． 1 培養基及膠原酶溶液的制備 M199 基礎培養基，添加 200 mL/L 胎牛血清、5 ng/mL 成纖維細胞生長因 子\\( fibroblast growth factor，FGF\\) 、肝素鈉、青霉素、鏈霉素等添加劑。配制 0． 1 g/L 的膠原酶溶液，用不含 Ca2 +、Mg2 +的Hanks 液加 1 型膠原酶，0． 22 μm 濾膜濾過除菌，置 37℃ 待用。
1． 2． 2 HUAEC 的分離 無菌條件下取出臍帶，在生物安全柜內剪去鉗痕和凝血塊阻塞部分，剪成 8 ～10 cm 一段，在臍帶一端剝離暴露出其中1 條臍動脈，用特制針頭\\( 可用小鼠灌胃針頭代替\\) 輕輕插入臍動脈斷端，可反復操作至針頭大部分進入動脈管腔，結扎固定針體，用 20 mL 一次性注射器吸取 PBS 后連接針頭，反復灌流沖洗臍動脈 2 遍，將管腔內殘血沖洗干凈，然后注入 37℃預熱的 1 型膠原酶溶液，待血管出口處有溶液流出時，用止血鉗夾閉出液端，使血管腔充盈飽滿后，將其置入 37℃培養箱中，消化 15 min。清洗和灌注時不要用力過大，否則消化液會沖破血管壁，進入組織間隙。
取出消化好的臍帶，沿夾閉端止血鉗內側剪斷臍帶，收集臍動脈內的消化酶溶液，然后注入 PBS 再次沖洗動脈管腔，以獲得更多的內皮細胞，將消化后的酶溶液和沖洗液一并注入50 mL 離心管，1 200 r / min，離心 5 min，棄去上清，加入M199 培養基打散細胞制成細胞懸液。
1． 2． 3 HUAEC 培養 用 0． 02 μL / mL 的鼠尾膠原預包被細胞培養瓶 37℃，30 min，接種細胞前吸去包被液。將細胞懸液按\\( 1 ～ 3\\) × 105個細胞接種于 25 cm2的培養瓶，置于37℃ 、50 mL / L CO2條件下培養，1 h 后即可觀察到有部分細胞貼壁，12 h 時后更換培養基去除未貼壁細胞，2 ～3 d 換液1 次，至細胞剛好融合時傳代。棄去培養瓶中的培養基，用PBS 清洗 1 次，然后加入 1 mL 含 0． 02 g / L EDTA 的 0． 5 g / L胰蛋白酶消化液，37℃，5 ～8 min，待細胞回縮變圓、浮起后加入 M199 培養液終止消化，用吸管輕輕吹打混勻，收集細胞懸液，1 200 r/min，離心5 min，棄去上清，用 M199 培養液重懸細胞按1∶3 比例接種傳代，每次傳代時密度不可太低，傳代后 2 d 左右細胞進入對數增長期，增殖較快，3 ～ 4 d 即可再次傳代，1 條臍動脈分離的 HUAEC 經過 2 次傳代可獲得\\( 6 ～8\\) ×106的細胞。
1． 2． 4 HUAEC 的形態學鑒定 利用倒置相差顯微鏡觀察活體細胞的形態特點。
1． 2． 5 免疫熒光染色檢測培養細胞的 CD31 表達 在 6 孔板內放置無菌蓋玻片 22 mm × 22 mm，將內皮細胞懸液和對照細胞接種于蓋玻片上，待細胞長至融合時，吸去培養液，用PBS 清洗蓋玻片，加入甲醛溶液固定 15 min，用 PBS 沖洗，再加入含有 BSA 和 Tween-20 的 PBS 溶液室溫孵育 1 h，PBS 沖洗3 次，在蓋玻片上滴加小鼠抗人 CD31 抗體工作液，另一蓋玻片滴加 IgG 工作液作陰性對照，放入濕盒內，室溫孵育 1 h。
用 PBS 沖洗3 次，每次10 min，滴加 Alexa fluor\ue4d1488 標記的抗小鼠 IgG，室溫孵育 30 min，用 PBS 沖洗 3 次，每次 10 min，用 DAPI 工作液復染細胞核，封片后熒光顯微鏡下觀察結果。
1． 2． 6 HUAEC 管狀結構形成試驗 在 48 孔細胞培養板內加入預冷的 Matrigel 膠，200 μL/孔，放置37℃，30 min，使之凝固。將 HUAEC 和人胚腎293A 細胞，分別按\\( 6 ～8\\) ×104/ mL的密度重懸在 M199 培養基中，取出 48 孔板加入細胞懸液200 μL / 孔，置于 CO2培養箱中。3 h 左右觀察并記錄形成管狀結構情況，人胚腎 293A 細胞作為對照。
2 結果
2． 1 內皮細胞的形態學觀察 倒置相差顯微鏡下觀察，分離培養的細胞為單層生長，呈鋪路石樣鑲嵌排列\\( 圖 1A\\) 。原代培養時，接種于培養瓶后 1 h 左右開始貼壁。最初細胞呈橢圓形，后逐漸伸展呈菱形，胞質豐富，胞核清晰可見，為圓形或橢圓形，細胞間可見相互連接。3 ～4 d 后，細胞基本融合。傳代細胞較原代細胞生長旺盛，有時可見多核細胞\\( 圖1B\\) ?！緢D1.略】
2． 2 內皮細胞特異性膜蛋白 CD31 的表達 熒光顯微鏡下可見內皮細胞胞膜呈特異性綠色熒光，細胞核 DAPI 染色為藍色。HUAEC 免疫熒光染色的結果顯示小鼠 IgG 呈陰性\\( 圖 2A\\) ，特異性膜蛋白 CD31呈陽性，且表達部位集中于細胞膜和細胞連接處\\( 圖 2B\\) 。該染色結果和表達水平與陽性對照組\\( HUVEC\\) 相類似\\( 圖2C、D\\) ，而陰性對照組\\( HepG2人肝癌細胞\\) CD31 無表達\\( 圖 2E、F\\) ，說明該陽性染色細胞為 HUAEC?！緢D2.略】
2． 3 血管內皮細胞管狀結構形成實驗 HUAEC 在基質膠表面呈浸潤生長、伸展，逐漸變形呈梭形，相互緩慢連接，形成大小不一的管腔樣結構\\( 圖 3A、B\\) ，對照組 293A 細胞呈圓球狀分散分布，無管狀結構形成\\( 圖 3C、D\\) ?！緢D3.略】
3 討論
近年來隨著高血壓、冠狀動脈粥樣硬化、心腦血管梗塞等動脈血管性疾病多發，有關動脈血管內皮細胞功能研究成為熱點，但受人體動脈材料來源限制，目前此類研究多以 HUVEC 或動物主動脈內皮細胞作為模型進行分析。然而，動脈和靜脈之間存在組織特異性，其內皮細胞生物學特性也存在差異，如: 動脈內皮細胞和靜脈內皮細胞中 VWF 含量不同等。此外，動物動脈內皮細胞與人動脈內皮細胞在生理功能和生物學特性等方面也有較大差異。因此，人體組織來源的動脈內皮細胞具有靜脈內皮細胞和動物組織來源的動脈內皮細胞不可替代的優勢。這一點已經為高血壓病理模型、脈沖式牽張力、剪切力等研究所證實。
目前動脈內皮細胞分離方法主要有組織機械刮脫法、組織塊培養法和組織消化法。機械刮脫法系直接刮剝血管壁內皮層獲取細胞，對內皮細胞損傷大，影響細胞胞吐、遷移等多種功能; 組織塊培養法是采用長時間培養血管組織，使細胞增殖、遷移后獲取細胞，該方法無法避免血管平滑肌、成纖維等非內皮細胞混雜其中; 也有學者采用在剪開的血管內壁表面滴加酶溶液消化后，回收培養，分離內皮細胞，受材料小和操作過程復雜限制，獲取細胞數量較少，極易污染。本研究采用灌流膠原酶消化臍動脈分離內皮細胞，避免了上述 3 種方法的不足之處，獲得細胞數量多、雜細胞少，對細胞的損傷小，減少了細胞被污染的幾率。經消化分離出的細胞呈鋪路石樣排列、內皮細胞特異性膜蛋白 CD31 表達呈陽性反應、HUAEC 通過自我組裝，在 Matrigel 上培養后能分化形成管狀結構，結果顯示內皮細胞特征明顯。
血管內皮細胞原代培養存在傳代生長緩慢以及貼壁困難等問題。本研究發現原代分離培養的HUAEC狀態與臍帶離體時間密切相關，臍帶離體后隨著時間延長，內皮細胞的活性逐漸下降、細胞狀態變差。有研究表明，臍帶離體超過 6 h 后易出現水腫、變性、活力下降，內皮細胞第Ⅷ因子相關抗原釋放量以及前列環素生長量均隨著時間的延長而呈下降趨勢。另外，在本實驗中于原代細胞接種前用鼠尾膠原或纖維蛋白膠原預包被細胞培養瓶，在培養瓶表面形成一層基質膜，有利于細胞貼壁、伸展、遷移和增殖，有效的解決了細胞貼壁難的問題。
以上研究結果證明采用膠原酶灌流消化法分離、培養 HUAEC，取材方便，操作過程簡單，分離所獲得的細胞可以在體外連續大量增殖傳代，解決了人源動脈內皮細胞獲取難的問題，為進一步研究動脈血管內皮細胞的生物學特性及其與各種疾病的關系奠定了基礎。
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