對腦梗死損傷機制的研究大多集中在缺血缺氧對神經元的影響，大量研究表明，缺血缺氧損傷可誘導神經元大量釋放谷氨酸，導致谷氨酸在細胞外液大量蓄積，引起谷氨酸的毒性作用，被認為是腦梗死損傷的主要機制。而近年的研究表明，星形膠質細胞也能夠釋放谷氨酸，參與神經系統的谷氨酸代謝。提示缺血缺氧損傷也有可能誘導星形膠質細胞釋放谷氨酸，從而加重谷氨酸的毒性作用。

本研究通過原代培養星形膠質細胞，采用氧氣葡萄糖剝奪\\( oxygen glucose deprivation，OGD\\) 模型體外模擬缺血缺氧損傷環境，觀察 OGD 刺激對星形膠質細胞谷氨酸釋放的影響。此外，由于連接子蛋白43\\( connexin 43，Cx43\\) 半通道是星形膠質細胞釋放谷氨酸的主要途徑，本研究還探討了 Cx43 半通道是否參與了 OGD 誘導的谷氨酸釋放。通過上述研究，以期探討腦梗死中樞神經系統損傷的機制，為腦梗死的臨床治療提供新的思路。

1 材料和方法

1． 1 材料
胎牛血清 \\( fetal bovine serum，FBS\\) 、DMEM 液為Invitrogen 公司產品; 小鼠抗膠質纖維酸蛋白 \\( glial fibrillaryacidic protein，GFAP\\) 抗體及兔抗 Cx43 多克隆抗體均為 Sigma公司產品; 兔抗 β-Ⅲ微管蛋白\\( β-Ⅲ tublin\\) 抗體為Promega公司產品; 熒光二抗購自 Jackson 公司; Gap26 為Severn Biotech公司產品; Cx43 反義寡核苷酸\\( antisense oligodeoxynucleotide，ASODN\\) 由 Sangon Biotech 公司合成; 高效液相色譜儀購自Waters 公司; 激光共聚焦顯微鏡購自 Lecia 公司; 新生大鼠購自解放軍總醫院第一附屬醫院實驗動物中心。

1． 2 方法
1． 2． 1 細胞培養 培養方法參見文獻［3］，具體方法如下:取新生 1 d 的 SD 大鼠，無菌取得腦組織，分離血管和腦膜后，將腦組織剪成小塊，1．25 g/L 胰酶消化后，用含100 mL/L FBS的 DMEM 液終止消化，將細胞懸液種入預先鋪有多聚賴氨酸的培養瓶中，密度為2．0 ×105個/cm2，于 37℃、50 mL/L CO2培養箱培養，每 3 d 換液 1 次。10 d 后，在 37℃恒溫搖床上240 r / min 振蕩 24 h，棄上清液。用 1． 25 g / L 胰蛋白酶消化后種植入涂有多聚賴氨酸蓋玻片的 24 孔培養板，種植密度1． 0 × 105個/cm2。簡要步驟如下: 多聚甲醛固定后，加入小鼠抗 GFAP 抗體\\( 1∶1 500\\) 或兔抗 β-Ⅲ tublin\\( 1∶1 000\\) 過夜;而后加入 FITC 標記的抗小鼠 IgG 或 FITC 標記的抗兔 IgG\\( 1∶500\\) ，結果顯示，星形膠質細胞的含量 ＞ 90%，并且不含有神經元。2 ～4 周傳代后，星形膠質細胞用于實驗。

1． 2． 2 實驗分組和缺糖缺氧刺激 星形膠質細胞隨機分為4 組: 正常對照組、OGD 刺激組、Gap26\\( Cx43 半通道阻斷劑\\)聯合 OGD 刺激組、Cx43-ASODN 聯合 OGD 刺激組。對于Gap26 聯合 OGD 刺激組，在刺激前，預先將星形膠質細胞與300 μmol / L Gap26 \\( VCYDKSFPISHVR \\) 共 孵 育 2 h; 對 于Cx43-ASODN聯合 OGD 刺激組，同樣預先將星形膠質細胞與Cx43-ASODN 共孵育 2 h。Cx43-ASODN 依據序列 5'-ACTC-CAGTCACCCAT-3' 而合成，它可以有效的抑制 Cx43 的表達。

缺糖缺氧損傷模型方法如下: 將星形膠質細胞培養7 ～ 9 d 后，將培養基置換成不含糖和氧的培養基，置于 37℃ 、950 mL / L N2、50 mL/L CO2、飽和濕度的培養環境下培養。

分別培養 0、15、30、60、90、120 min。每一培養時段各設6 個平行樣本\\( n = 6\\) 。

1． 2． 3 細胞外液谷氨酸測定 在每個刺激時間點，提取細胞培養液，離心 4 min 后，取上清，采用高效液相色譜\\( highpressure liquid chromatography，HPLC\\) 來測定細胞外液谷氨酸濃度。具體方法詳見文獻。

1． 2． 4 免疫熒光染色測定星形膠質細胞 Cx43 和 GFAP 的表達情況 各組細胞用 40 g/L 多聚甲醛液固定 30 min\\( 室溫\\) ，吸出固定液，0． 01 mol/L PBS 洗 3 次。星形膠質細胞培養孔中加入小鼠抗 GFAP 單克隆抗體\\( 1∶1 500\\) 和兔抗 Cx43 多克隆抗體\\( 1∶1 500\\) 混合液，4℃過夜，而后星形膠質細胞換為與第一抗體相應的結合了熒光素的二抗混合液，避光孵育 2 h，0． 01 mol / L PBS 洗 3 次后，800 mL / L 甘油封片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結果。

1． 2． 5 統計學分析 各組數據以 x ± s 表示，采用多個樣本均數比較的方差分析及多重比較的 LSD-t 檢驗進行統計學分析。P ＜0． 05 認為差異具有統計學意義。

2 結果

2． 1 OGD 升高細胞外液谷氨酸濃度 采用 HPLC法，測定了不同時間點細胞外液的谷氨酸濃度。結果發現，正常狀態下\\( 0 min\\) ，細胞外液谷氨酸濃度大致為\\( 2． 43 ±0． 17\\) nmol/mL。而 OGD 刺激后，細胞外谷氨酸濃度逐漸升高，并在刺激 90 min 后，達到峰值，為\\( 5． 00 ± 0． 30\\) nmol/mL，顯著高于對照組，差異有統計學意義\\( P ＜0． 05\\) 。該結果表明，缺糖缺氧刺激可以顯著升高細胞外液谷氨酸水平，說明缺糖缺氧刺激可以促進星形膠質細胞釋放谷氨酸?！颈?】


2． 2 缺糖缺氧損傷誘導星形膠質細胞表達 Cx43 蛋白 在星形膠質細胞膜上，Cx43 蛋白構成 Cx43 半通道，是星形膠質細胞釋放谷氨酸的主要通路之一。

本研究探討了 OGD 刺激對細胞 Cx43 蛋白的影響。

通過免疫熒光染色發現，對照組 Cx43 蛋白的平均熒光強度 \\( mean fluorescence intensity，MFI\\) 為\\( 80 ±28\\) 自由單位 \\( arbitrary unit，AU\\) 。OGD 刺激后，Cx43 蛋白表達的信號強度明顯升高，在刺激60 min后，其 MFI 達峰值，為\\( 158． 00 ± 43． 00\\) AU，顯著高于對照組\\( 圖 1\\) 。說明 OGD 刺激可誘導星形膠質細胞表達 Cx43，為谷氨酸的進一步釋放提供了通路。OGD 刺激也能促進 GFAP 的表達，GFAP 的信號強度也明顯升高，刺激 60 min 時，對照組為\\( 98． 00 ±24． 00\\) AU; OGD 刺激組為\\( 170． 00 ± 34． 00\\) AU，說明缺糖缺氧刺激也激活了星形膠質細胞?！緢D1.略】

2． 3 Cx43 半通道阻斷劑 Gap26 能夠抑制缺糖缺氧刺激誘導的谷氨酸釋放 Gap26 是特異性的 Cx43 半通道阻斷劑，本實驗采用 Gap26 阻斷 Cx43 半通道，以探討 Cx43 半通道在缺糖缺氧刺激誘導谷氨酸釋放中的作用。

Gap26 預處理星形膠質細胞后，經過缺糖缺氧刺激，細胞外液谷氨酸濃度顯著低于單純缺糖缺氧刺激組\\( 表 2\\) 。在刺激 90 min 后，細胞外液谷氨酸濃度為\\( 3． 93 ±0． 32\\) nmol/mL，比單純 OGD 刺激組減少了 50%\\( P ＜0． 05\\) 。說明 OGD 刺激下，星形膠質細胞通過 Cx43 半通道釋放谷氨酸。此外，還發現Gap26 預處理后，OGD 刺激 60、90、120 min 后，細胞外液谷氨酸濃度還是高于對照組，說明 Cx43 半通道也并非唯一的釋放途徑。此外，為排除 Gap26 的非特異性反應，本研究還選用了亂序 Gap26 肽段\\( scrambled Gap26 peptide，Scrb Gap26\\) 來預處理星形膠質細胞，Scrb Gap26 預處理后，給予缺糖缺氧刺激，細胞外液谷氨酸濃度與單純缺糖缺氧刺激組間無顯著性差異\\( P ＞0． 05，表 2\\) ?！颈?】


2． 4 Cx43 特異性反義寡核苷酸\\( Cx43-ASODN\\) 能夠阻斷缺糖缺氧刺激誘導的谷氨酸釋放 既往研究表明，應用 Cx43 特異性 ASODN 可以暫時性敲除Cx43 蛋白，從而阻斷了 Cx43 半通道的形成。本研究發現，采用 Cx43-ASODN 抑制 Cx43 表達后，缺糖缺氧刺激 60、90、120 min 后，細胞外液谷氨酸濃度顯著低于單純缺糖缺氧刺激組。刺激 90 min 后，細胞外液谷氨酸濃度為\\( 4． 02 ± 0． 18\\) nmol/mL，顯著低于單純缺糖缺氧組的\\( 5． 00 ± 0． 30\\) nmol/mL\\( P ＜0． 05\\) 。同樣，為排除 ASODN 的非特異性反應，我們還選用了亂序 ODN 作為陰性對照。結果表明，亂序 ODN 對于谷氨酸的釋放沒有影響?！颈?】


3 討論

谷氨酸的興奮性毒性作用在腦梗死的神經功能損害中起到了非常關鍵的作用。腦梗死期間，神經元通過突觸末梢釋放大量的谷氨酸至突觸間隙，同時突觸后膜和星形膠質細胞對谷氨酸再攝取作用減弱，致使細胞外液大量的谷氨酸聚集，過度刺激突觸后膜的谷氨酸受體引起神經元持續去極化，從而干擾神經元的功能。

星形膠質細胞通常被認為對神經元具有支持和保護作用，但同時對細胞外液谷氨酸的濃度也具有調節功能。主要調節方式為通過谷氨酸轉運體\\( functional glutamate transporters\\) 將細胞外液的谷氨酸轉運至細胞內。但近年研究發現，星形膠質細胞也能夠主動釋放谷氨酸。本研究結果表明，缺糖缺氧刺激后，細胞外液谷氨酸濃度顯著增高，這提示:缺糖缺氧促進星形膠質細胞谷氨酸的釋放，這可能是腦梗死時谷氨酸毒性作用的另一機制。星形膠質細胞主動釋放谷氨酸的途徑很多，其中最為主要的有以下幾種方式: 谷氨酸再攝取轉運體逆向轉運、與胞吐偶聯的 Ca2 +依賴性谷氨酸釋放、陰離子釋放通道、功能性 pannexin1 通道、嘌呤受體介導的谷氨酸釋放、Cx43 半通道。在本研究中，我們僅探討了 Cx43 半通道在缺糖缺氧環境中的作用。研究結果表明，缺糖缺氧環境下，Cx43 半通道參與了谷氨酸的釋放。此外還發現，缺糖缺氧環境下，Cx43 表達的峰值\\( 60 min\\) 先于谷氨酸釋放的峰值\\( 90 min\\) ，這是因為 Cx43 蛋白自內質網合成后，只有通過高爾基體轉運至細胞膜表面，才能發揮其功能，形成功能性半通道，因此存在一定的“時間差”。

當然，本研究并不能排除其他方式的釋放途徑。

例如，最近的研究就發現，缺糖缺氧刺激能夠誘導嘌呤受體 P2X7 的表達，提示嘌呤受體也可能參與了缺糖缺氧誘導的谷氨酸釋放。此外，OGD 損傷也可以降低星形膠質細胞谷氨酸轉運體的表達，這將間接導致谷氨酸在細胞外液的蓄積。這些潛在的機制就解釋了為什么阻斷 Cx43 半通道只能部分而非完全抑制 OGD 誘導的細胞外液谷氨酸濃度的升高。

Cx43 半通道由 3 個縫隙連接蛋白構成，在中樞神經系統，主要表達于星形膠質細胞。Cx43 在中樞缺血缺氧損傷中的作用，目前還尚存在爭論。一般認為，Cx43 半通道可以迅速的傳遞損傷或死亡信息至周圍的細胞，導致周邊區細胞出現凋亡或死亡，即縫管連接介導的旁觀者效應\\( gap junction-mediatedbystander effect\\)。對于海馬急性梗死大鼠，抑制Cx43 蛋白表達可以增加海馬區存活神經元的數量，并且提高大鼠的神經功能學評分。但也有研究發現，Cx43 半通道可以將一些有益的神經營養因子、遞質或第二信使傳遞至周邊細胞，從而產生一系列神經保護作用\\( good samaritan effect\\)。但究竟是哪種效應占據上風，還要視損傷時間和損傷程度而定。

總之，本研究發現，缺糖缺氧刺激可以誘導星形膠質細胞通過 Cx43 半通道釋放谷氨酸，可能進一步加重了缺糖缺氧損傷所致的谷氨酸毒性作用，這為缺血缺氧性腦損傷的治療提供了新的途徑。

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