前言

神經膠質瘤是最常見的中樞神經系統原發性腫瘤，其發病率占全部顱內腫瘤的 40 %，我國每年新查出此病患者為約為10 萬人。雖然膠質瘤的發生率\\(3/105\\)比大多數其它腫瘤的發生率低,但因為它的無限增殖能力和侵襲性生長直接危及瘤體周圍的很多重要的生命調節中樞以及對目前各種治療不敏感,在腫瘤周圍 2 cm 以內的腦組織中均可能有腫瘤細胞生長，所以預后比任何其他系統的腫瘤要差得多，發病率高，預后差，盡管經過積極的外科手術治療和化療，其中位生存時間仍然不超過一年時間，給患者和患者家屬及社會帶來了沉重的醫療和精神負擔，鑒于此，尋找新型抗腫瘤藥物具有十分重要的深遠意義。太白銀蓮花（Anemone taipaiensis）為毛莨科，銀蓮花屬，產自我國陜西秦嶺，生長于海拔 2900-3700 米間山地草坡或多石礫處。太白銀蓮花皂苷 B 是第一次從太白銀蓮花中經過系統化學分析和分離鑒定的皂苷之一，所以它的生物學效應目前仍然不清楚，在這篇文章中我們第一次研究了太白銀蓮花皂苷 B對人類膠質瘤細胞的生長影響，探索其對人膠質瘤細胞的生長抑制和促凋亡作用，為臨床藥物治療惡性膠質瘤開拓了廣闊的前景。

1、 材料與方法

1.1 細胞系和試劑

人源性膠質瘤細胞系 U87MG、U251MG、ECV304（人臍靜脈內皮細胞）購買于美國 ATCC 公司，太白銀蓮花皂苷 B（分子式：C70H114O34，分子量：1498）純品由第四軍醫大學藥劑科湯海峰教授提供。分子結構為 3β-O- {β-D-xylopyranosyl- \\(1→3\\)-α-L-rhamnopyranosyl- \\(1 →2\\)- [β-D-glucopyranosyl- \\(1 →4\\)]-α-L-arabinopyranosyl} oleanolic acid 28-O- { α-L-rhamnopyra-nosyl- \\(1 →4\\)-β-D-glucopyranosyl- \\(1 →6\\)-β-D-glucopyranoside},高效液相色譜法\\(HPLC\\)分析其純度大于 95 %（圖 1）。純品溶解于 DMSO,母液儲存于 -20 ℃冰箱，濃度為 500 μg/mL，實驗前取出稀釋至工作濃度分裝備用，分裝液儲存于 -4 ℃冰箱，各實驗組太白銀蓮花皂苷 B 工作液中含 DMSO 濃度均不超過1‰\\(v/v\\) 以免影響皂苷 B 的生物學作用和膠質瘤細胞的活性。

MTT 購自 Sigma 公司，10 % 胎牛血清、DMSO 溶劑、DMEM 培養基和胰酶均購自 GIBCO 公司，PBS 購自西安化學試劑廠，96孔板購自英國 CORNING 公司。

1.2 太白銀蓮花皂苷 B 對 U87MG 和 U251MG 細胞增殖的影響\\(MTT 法\\)

用含 10 % 胎牛血清的 DMEM 培養液，在 37 ℃、5 % CO2培養箱中培養，取對數生長期的 U87MG 和 U251MG 細胞，經0.25 %胰酶消化后，經過細胞計數后，調整細胞密度為 3×104/mL，邊震蕩邊種植于 96 孔板，每孔體積為 200 μL，過夜貼壁，將太白銀蓮花皂苷 B 加入培養液中配制不同濃度的藥物，使其終濃度為 0.5，1，2，4，8，16，32，64 μmol/L, 每個濃度有 6 個復孔，對照組為正常培養的細胞中加入 MTT 20 μL，37℃孵育 4h，小心棄上清，加入 150 μL DMSO，空白對照組沒有細胞，其他的處理與藥物組相同。在 37 ℃、5 % CO2培養箱培養 72 h后，每孔加入 5 mg/ mL 的 MTT 20 μL，37 ℃孵育 4 h 后，小心吸棄孔內上清，每孔加入 150 μL DMSO,震蕩 10 min,使結晶充分溶解，在酶聯免疫儀上選擇 490 nm 波長測定吸光度值\\(OD值\\)，計算 6 孔的平均值。以 OD 值間接計算出 72 h 的 IC25，IC50，IC75，抑制率 =\\(對照組 OD 值 - 用藥組 OD 值\\)/ \\(對照組 OD值 - 空白組 OD 值\\)×100 %。

1.3 熒光顯微鏡下觀察經過 Hoechst 33342 染色后細胞核的形態學變化取對數期生長狀態良好的 U87MG 細胞，消化，離心，重懸，計數，調整細胞濃度至 2×104/ mL，培養于 24 孔細胞培養板，200 μL / 孔，置 37 ℃、飽和濕度、5 % CO2的培養箱中培養。

24 小時后細胞生長貼壁，將細胞分為對照組，處理組，然后加入太白銀蓮花皂苷 B 工作液（其終濃度為 IC25，IC50，IC75），每個濃度有 6 個復孔，對照組細胞不作任何處理；置 37 ℃、飽和濕度、5 % CO2的培養箱中繼續培養 8 h 和 24 h，在含有 10 % 胎牛血清的 DMEM 高糖培養液的 96 孔板中，室溫 25 ℃以上，光學顯微鏡下觀察，并采用照相系統進行照相和分析。接著向 24孔板中加入 3 μL Hoechst 33342，37 ℃、5% CO2培養箱中孵育10 min，在熒光顯微鏡下檢測細胞核。激發波長 350 nm，發射波長 460 nm，逐步進行后熒光顯微鏡下照相。

2、 結果

2.1 太白銀蓮花皂苷 B 對人膠質瘤細胞增殖和活性的影響不同濃度的太白銀蓮花皂苷 B 作用于 U87MG 和U251MG 細胞后，觀察 72 h 的細胞生長抑制曲線，可以看出，太白銀蓮花皂苷 B 對膠質瘤細胞的生長抑制有劑量依賴性效應，能顯著抑制細胞的生長，降低生存率。通過生長抑制曲線計算出太白銀蓮花皂苷 B 作用于 U87MG 細胞 72 h 的 IC25，IC50，IC75分別為 5.2 μmol/L，6.7 μmol/L，8.7 μmol/L，U251MG 的IC25，IC50，IC75為 6.2 μmol/L，7.9 μmol/L，10.5 μmol/L。皂苷 B對 ECV304 沒有顯著的生長抑制作用（圖 2）。

2.2 經 Hoechst 33342 染色后，細胞形態學的變化典型的細胞凋亡形態學特征：細胞皺縮成圓球形，細胞核碎裂或者致密濃染，向核膜邊緣聚集，染色質濃縮為半月狀、車輪狀或者馬蹄狀，凋亡小體出現。U87MG 細胞經過藥物處理后，Hoechst 33342 染色，在熒光顯微鏡下和光學顯微鏡下觀察，正常細胞核熒光素染色較淺，細胞核較大，呈橢圓或者圓形，隨著藥物劑量和時間的變化，U87MG 細胞逐漸呈現出典型的凋亡形態學變化，這些特征在 24 h 時更明顯（圖 3）。

3、 討論

惡性膠質瘤，被歸類到血管源性的腫瘤當中，它相比中樞神經系統的其他腫瘤，有更高的發病率，腫瘤中有豐富的血供，而且外侵性特別強。目前的治療手段包括外科治療，放射治療，還有化學治療，盡管在最佳治療方案的積極治療后，患者的預后仍然很差，平均生存時間不超過一年時間。眾所周知，中國在治療許多疾病方面有很好的療效，據報道，從 1940 年到2006 年的 155 種小分子抗腫瘤藥物當中，有 47% 的藥物是天然化合物或者從從它們中衍生而來。在腫瘤的研究領域中，利用中草藥提純出來的試劑來治療腫瘤是一個新興的研究領域。

太白銀蓮花是秦嶺的一種野生植物，生長于海拔2900-3700 米間山地草坡或多石礫處。Xiao-Yang Wang 等從太白銀蓮花中提取出了 8 個皂苷單體，對人類白血病細胞HL-60、肝癌細胞 Hep-G2 細胞有顯著的細胞毒作用。太白銀蓮花皂苷 B 是首次從太白銀蓮花中提純出來的皂苷單體，所以它的生物學效應目前仍然不太清楚，此研究表明太白銀蓮花皂苷 B 對惡性膠質瘤 U87MG 和 U251MG 細胞有強烈的細胞毒效應，通過 MTT 實驗可以看出，它對膠質瘤細胞具有劑量依賴性的生長抑制作用，其抗腫瘤作用可能有多種生物機制的參與，比如干涉細胞周期進程和促進凋亡。

藥物處理后的細胞經過 Hoechst 33342 染色后，熒光顯微鏡下觀察，凋亡的細胞聚集成團塊，細胞體積皺縮，從 24 孔板壁脫離，細胞核碎裂或者致密濃染，向核膜邊緣聚集，染色質濃縮為半月狀、車輪狀或者馬蹄狀，凋亡小體出現。這些典型的凋亡特征在 24 h 比 8 h 更顯著，可以看到 Hoechst 33342 染色實驗結果與光鏡下的變化相一致。

細胞凋亡（Apoptosis）又稱程序性細胞死亡\\(programmedcell death，PCD\\)，涉及一系列基因的激活、表達以及調控，是由基因控制的細胞自主的有序性死亡方式。通過實驗結果可以發現，太白銀蓮花皂苷 B 對人類惡性膠質瘤細胞 U87MG 和U251MG 有強烈的劑量和時間依賴性的細胞毒效應，顯著抑制了膠質瘤細胞的增殖，細胞核呈現出典型的細胞凋亡的形態學改變，其機制可能是通過活化凋亡途徑而引起了細胞增殖的抑制。由于目前對其抗腫瘤作用研究還處于起步階段，在動物及人的體內毒性實驗、劑量控制及臨床療效都需要科學的評價，通過實驗可以看出，太白銀蓮花皂苷 B 具有促進膠質瘤細胞凋亡的作用，闡明其促凋亡的相關機制，可為為后續的動物實驗和臨床研究奠定基礎，為臨床治療惡性膠質瘤開拓廣闊的前景。