腸道病毒71型\\(EV71\\)屬于小RNA病毒科,是引起兒童手足口病和中樞神經系統感染的主要病原之一[1]。在臨床上致殘率及病死率均較高。近年來,EV71的流行在亞太地區呈上升趨勢[2]。EV71感染取決于病毒、宿主及環境的多重作用,但目前其發病機制及免疫學特點尚未明確,因此,從宿主遺傳易感因素出發探討與病毒感染的相關性越來越受到重視[3]。人2′-5′寡聚腺苷酸合成酶\\(OAS\\)是一類由干擾素\\(IFN\\)誘導產生的酶蛋白,主要由OAS-1、OAS-2和OAS-3基因編碼,能夠激活潛在性RNA酶\\(RNase L\\),從而降解病毒mRNA、抑制病毒蛋白合成和促進病毒感染細胞發生凋亡,構成了清除病毒的第一道關卡[4-5]。鑒于OAS在抑制病毒復制過程中發揮的作用,本實驗采用序列特異性引物-聚合酶鏈反應\\(PCR-SSP\\)技術,分別檢測EV71感染病兒OAS1外顯子-6區rs-1131476\\(G/A\\)位點、OAS2內含子-2區rs1293767\\(G/C\\)位點及OAS3的5′端rs7132797\\(C/A\\)位點單核苷酸多態性\\(SNP\\),探討其與EV71易感性及感染后嚴重程度的關系,從而進一步了解EV71的遺傳易感因素。
1對象與方法
1.1研究對象
2011年11月—2012年12月,收集我院及青島市婦女兒童醫院EV71感染手足口病病兒163例,男107例,女56例;年齡1.3~6.7歲。其中重癥72例,均為年齡3.5歲以下,占總數的44.1%。根據衛生部《手足口病診療指南\\(2010年版\\)》,將163例病兒分為輕癥組\\(91例,為輕癥手足口病\\)和重癥組\\(72例,均合并不同程度中樞神經系統損害表現\\)。另收集同期同地區健康體檢兒童103例作為對照組,男62例,女41例,年齡1.2~9.7歲。對照組兒童無臨床感染癥狀,血常規及生化指標檢查均在正常范圍內。
1.2研究方法
1.2.1標本采集采集手足口病病兒急性期\\(病程前3d內\\)糞便標本和靜脈EDTA抗凝血3mL,對合并中樞系統感染者同時采集腦脊液,且經RT-PCR檢測糞便及腦脊液EV71病毒核酸均為陽性。
1.2.2標本基因組DNA制備采用天根公司全血DNA提取試劑盒,按試劑盒操作說明提取ED-TA抗凝血人基因組DNA,按照入選病兒的統一編號標注后,置于-20℃保存備用。
1.2.3 Hardy-Weinberg平衡定律檢測根 據Hardy-Weinberg平衡定律,分別對EV71感染組與對照組OAS1基因外顯子-6區rs1131476\\(G/A\\)位點、OAS2內 含 子-2區rs1293767\\(G/C\\)位 點 及OAS3的5′端rs7132797\\(C/A\\)位點各等位基因的檢測數和預期數進行檢驗,P均>0.05,提示兩組人群均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。
1.2.4 OAS1、OAS2及OAS3基因SNP的PCR檢測擴增各基因位點特異性引物\\(序列見表1\\),由上海天昊遺傳分析中心合成。
PCR擴增條件:反應體積為7.5μL,其中含20ng模板DNA,0.2mmol/L的dNTPs,0.5μmol/L上、下游引物,0.5U Taq-DNA聚合酶,和10×PCR緩沖液1μL。反應條件:95℃預變性2min;隨之94℃變性20s、60℃退火30s、72 ℃延伸90s,重復35個循環;最后72℃末延伸2min。反應完成后對擴增產物進行判讀,剩余產物置于-20℃保存。
1.3數據分析
應用SPSS 17.0軟件進行分析,基因型和等位基因頻數分布比較采用卡方檢驗,以P<0.05為差異有顯著性。
2、結果
感染組與對照組、輕癥與重癥組OAS2內含子-2區rs1293767\\(G/C\\)位點基因型GC+CC頻數分布分別為37、25、22、15例,GG頻數分布分別為126、78、69、57例,組間比較差異無顯著意義\\(P>0.05\\);等位基因C頻數分布分別為38、27、22、16,G頻數分布分別為288、179、160、128,組間的差異無顯著性\\(P>0.05\\)。感染組、對照組、輕癥組與重癥組OAS3的5′端rs7132797\\(C/A\\)位點AA、CA、CC基因型分布分別為13、61、89例,9、46、48例,10、36、45例,3、25、44例,組間比較差異無顯著意義\\(P>0.05\\);等位基因A、C頻數分別為87、239,64、142,56、126,31、113,組間比較差異無顯著性\\(P>0.05\\)。而OAS1外顯子-6區rs1131476\\(G→A\\)位點,如表2、3所示,163例EV71感染病兒與103例正常對照兒童均存在OAS1基因多態性,基因型分布以GA、AA最為常見,等位基因以A型多見。重癥病兒OAS1位點A等位基因頻率明顯高于輕癥病兒\\(χ2=7.002,P<0.05\\);輕、重癥組間AA基因型分布頻率比較差異有顯著意義\\(χ2=6.389,P<0.05\\);而感染組與正常對照組相比,差異均無顯著性\\(P>0.05\\)。
3、討論
EV71屬于小RNA病毒科,是引起兒童手足口病及中樞神經系統感染的主要病原之一。
EV71感染病兒病情大多較輕,病程呈自限性,重者可出現腦干腦炎、神經源性肺水腫或心肺衰竭。EV71感染發病機制尚未清楚,但宿主基因組與EV71易感性 的關系越來越受到重視,從微觀水平探討EV71感染的遺傳易感機制是目前研究的主要方向之一。
本研究通過檢測163例EV71感染病兒與103例正常對照兒童OAS1、2、3基因多態性,發現OAS2內含子-2區rs1293767\\(G/C\\)位點和OAS3的5′端rs7132797\\(C/A\\)位點各基因型及等位基因的頻數分布在EV71感染組與對照組、輕癥與重癥組間差異無顯著性。
OAS1外顯子-6區rs1131476\\(G→A\\)位點AA基因型頻率在輕、重癥間差異有顯著性,且重癥病兒A等位基因頻率明顯高于輕癥病兒,而感染組與對照組相比,差異均無顯著性。提示攜帶A等位基因可能不會增加EV71的患病風險,但感染后會增加進展為重癥的可能性。
OAS是一種干擾素誘導產生的抗病毒蛋白,同時也是細胞對細胞內應激和環境應激發生反應的信號通路中的一種重要信號激酶。在人體細胞中OAS主要有3種形式,OAS1、OAS2、OAS3。3種基因均位于12q24,其結構上的相似以及位置上的毗鄰提示其具有共同調節細胞生長、分化、凋亡及抗病毒等功能。細胞受到EV71侵染后,誘導產生的OAS與病毒復制過程中產生的dsRNA結合并發生自身磷酸化后被激活,進而催化由ATP合成2′-5′寡聚腺苷酸\\(2′-5′A\\),2′-5′A再激活細胞內的RNaseL,從而降解病毒和細胞內的RNAs。同時,OAS也可以增強IFN的抗病毒作用。我們的全基因測序結果顯示,OAS1外顯子-6區rs1131476\\(G/A\\)位點鳥嘌呤\\(G\\)-腺嘌呤\\(A\\)的顛換,可導致密碼子變化\\(GCA-ACA\\),使蘇氨酸轉變為脯氨酸,但目前有關氨基酸改變對OAS1結構及功能的影響知之甚少。為明確OAS1外顯子-6區rs1131476\\(G/A\\)位點基因多態性與EV71感染易感性及感染的嚴重程度的具體機制,在繼續增加樣本量同時,仍需從OAS1蛋白的結構和功能改變方面做進一步的研究。
參考文獻：
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[2]KOMATSU H,SHIMIZU Y,TAKEUCHI Y,et al.Out-break of severe neurologic involvement associated with Entero-virus 71infection[J].Pediatr Neurol,1999,20\\(1\\):17-23.
[3] 趙娜,陳宗波,錢娜,等.IFN-γ+874位點單核苷酸多態性和蛋白表達水平與腸道病毒71感染關系[J].齊魯醫學雜志,2010,25\\(4\\):315-317,3.
