哺乳動物卵透明帶（zona pellucida, ZP）是覆蓋于卵母細胞及著床前受精卵外的一層糖蛋白基質。小鼠卵透明帶和人類的相似，由ZP1、ZP2、ZP3三種糖蛋白組成。傳統觀點認為，ZP3是第一精子受體和頂體反應的誘導物，ZP2 是第二精子受體參與精卵識別過程，能與頂體反應后的精子結合。因此，早期研究主要集中在ZP3.但是，近幾年的研究實驗顯示ZP2在精卵識別起到很關鍵的作用。重組人ZP2 39-154肽段則可抑制人精子與透明帶結合[1],小鼠ZP2的35~637肽段能夠造成其免疫不育[2].用重組人ZP2肽段免疫獼猴和狒狒，均導致明顯的免疫不育效果[3].用在E.coli中表達的重組帽猴ZP蛋白（包括ZP1和ZP2）免疫雌性帽猴，也導致生育率明顯降低[4].重組mZP2 121-140肽段誘發的抗體能與小鼠卵巢透明帶特異結合并降低小鼠的繁殖力[5],說明ZP2在受精過程中其著重要的作用。

Dean 等進一步將人類的 ZP1、ZP2、ZP3 或 ZP4 基因導入小鼠，分別得到產生含人ZP1、ZP2、ZP3或ZP4的小鼠透明帶嵌合體[1].這種用人的特定ZP蛋白取代小鼠自身ZP蛋白的轉基因小鼠實驗顯示，人類精子只結合嵌入人ZP2的轉基因小鼠的透明帶，而且，嵌合人ZP2 的透明帶在受精后仍能保持與精子結合[6].定點突變消除小鼠ZP2的切割位點，該ZP2突變的透明帶在受精后能保持與精子的結合[7].說明小鼠ZP2在精卵結合中起關鍵作用。

近年來的研究突顯ZP2的重要，有待深入研究。我們近年的研究發現，與許多其它動物的透明帶相似，小鼠卵泡的顆粒細胞也參與ZP2的發生[8-9].抗體是研究透明帶生化特性和功能的重要工具，通過基因工程表達透明帶蛋白是制備抗體簡便有效的途徑，但國內實驗室主要探討表達生產ZP3[10-14],很少研究ZP2.目前還沒有報道國內其它實驗表達ZP2蛋白，更沒有制備抗體。為了對ZP2的功能進行更深入的研究，制備ZP2抗體很必要和迫切。

1 材料與方法

1.1 抗原的制備

參見文獻[15]方法利用Rosetta-gam（iDE3）pLysS菌株體外表達重組小鼠ZP2肽段mZP2201-515,取重組質粒mZP2轉化菌和Rosetta宿主菌的超聲裂解上清進行SDS-PAGE電泳分離目的蛋白。通過染色對照，從凝膠上切下目的蛋白所在位置的膠條，對照菌裂解上清電泳分離后在對應位置切下膠條，稱重，在冰上研缽內研磨直至凝膠為均勻的細小顆粒，再按質量體積比1∶1加入PBS和等體積的弗氏佐劑乳化。首次免疫使用弗式完全佐劑，強化免疫用弗式不完全佐劑。

1.2 免疫方法

分別用目的蛋白膠和對照膠的乳化抗原通過皮下多點注射途徑免疫新西蘭雄兔（實驗組和對照組）。首次免疫劑量含重組抗原大約l mg.2周后強化免疫，以后每隔1周強化免疫1次，共4次，每次劑量約含重組抗原0.5 mg.每次免疫前都從耳緣靜脈采血，分離血清，-20℃保存備用。停止免疫1周后心臟采血分離血清。

1.3 ELISA檢測抗血清及其效價

以分離的重組蛋白為包被抗原包被ELISA板，重組蛋白調整濃度至5 μg/孔。ELISA檢測兔血清時，實驗組和陰性對照組抗血清分別按1∶5000稀釋，二抗用1∶10 000稀釋的羊抗兔IgG- HRP（武漢博士德公司）。以D490值為Y軸，以免疫采血次數為X軸來繪制抗重組抗原的IgG抗體反應曲線。取ELISA檢測反應強度最強的末次兔血清按1∶5000~1∶160 000稀釋6個不同的倍數梯度作為一抗，按1∶10 000稀釋羊抗兔IgG- HRP作為二抗，測定D490值。

1.4 免疫組化檢測抗血清特異性

將兔抗ZP2血清依次稀釋1∶100、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶5000、1∶10 000 6個倍數，分別覆蓋于小鼠卵巢切片上，對照組切片加對照兔血清，放入濕盒中在37 ℃放置5 h.洗滌后繼續孵育CY3標記的羊抗兔IgG（Sigma）。在熒光顯微鏡下觀察卵巢切片的染色情況。

1.5 孕酮誘導精子頂體反應將獲能后的小鼠精子分成兩組，對照組加入DMSO,實驗組加入終濃度為25 μmol/L的孕酮（廣州明興制藥廠），誘導頂體反應1 h.用PBS清洗精子后涂片。用PNA-FITC（Sigma）和Hoches（tSigma）同時對精子的頂體以及精子核進行雙標記。在熒光顯微鏡下觀察精子的著色情況。

1.6 精卵結合實驗。用PMSG（寧波第二激素廠）和HCG（麗珠藥業）對昆明小鼠促排卵，卵母細胞分成兩組，對照組卵轉移到含對照兔血清的微滴中，實驗組卵轉移到含有兔抗mZP2抗體的培養微滴中，血清稀釋200倍，CO2培養箱中孵育1 h后，將兩組卵母細胞分別移入新的M2培養液中以洗去卵子上殘余的抗體。分別加入誘導頂體反應后的精子懸液各20 μl,放入CO2培養箱中精卵結合1 h.在體視鏡下將卵子移入新的M2培養液滴中洗去游離的精子。將每個卵子（含其上結合的精子）分開放入一小滴PH 2.0的乳酸溶液消化透明帶。在10×20倍鏡下計數從卵子上脫落下來的精子，即為卵子結合的精子數。

2 結果與分析

2.1 免疫兔的抗體滴度

取通過ELISA檢測結果顯示，7次所采的實驗組和對照組兔血清，隨免疫次數的增加，實驗組抗體反應強度不斷上升，第4次免疫后反應強度顯著提高。對照組兔血清的免疫反應沒有明顯變化（圖1）。

取反應強度最強的末次免疫兔血清來檢測抗血清效價，抗血清分別按1∶5000,1∶10 000,1∶20 000,1∶40 000,1∶80 000,1∶160 000六個不同的倍數梯度稀釋，通過間接ELISA檢測相應的D值如圖2.顯示即抗體滴度達到20 000.

2.2 抗mZP2抗體與卵巢切片透明帶的反應

用1∶100、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶5000 1∶10 000 6個稀釋度的兔抗mZP2抗血清分別孵育小鼠卵巢組織切片，而后加入CY3標記二抗，免疫熒光實驗結果顯示，實驗兔抗血清特異地結合小鼠卵巢組織切片上的透明帶成分，并且隨著血清稀釋倍數的增加，熒光著色程度逐漸減弱，抗體稀釋 5000 倍時仍有熒光顯色（圖3A~E），普通兔血清沒有與卵巢組織發生特異反應（圖3F）。顯示免疫兔血清產生了能特異結合卵巢透明帶的抗mZP2抗體。

2.3 抗血清影響頂體反應后的精子與卵子結合

如圖4所示，精子標本經PNA-FITC和Hochest雙染色后，蘭色熒光顯示精子核，綠色熒光顯示呈彎月形的精子頂體。未經孕酮誘導的對照組，大部分精子可顯示蘭色精子核和對應位置的綠色頂體，頂體區域綠色熒光呈彎月形（圖4A,B）。用孕酮處理后，許多蘭色精子頭缺少對應的綠色熒光，或者綠色熒光變淺，表明精子頂體發生頂體反應（圖4C,D）。初步統計，用孕酮誘導過頂體反應之后的精子AR率可達39%,明顯比對照組精子的頂體反應率高（P<0.001）。

用孕酮誘導頂體反應后的精子分別與對照兔血清和兔抗mZP2抗血清孵育后的卵子共培養后，兩組卵子結合精子的數目也有明顯差異（圖5）。用對照血清處理的卵子結合AR精子數為每個卵子143.8±6.126（n=32），用實驗組抗血清處理的卵子結合AR精子數為每個卵子80.9±3.461（n=28），結合的AR精子數明顯減少（P<0.05,表1）。說明抗ZP2抗體減少卵子結合AR精子數。

3 討論

本文選取了300多個氨基酸的小鼠mZP2201-515肽段免疫新西蘭雄兔制備抗體，初步研究其免疫原性，經ELISA檢測，抗體滴度一直隨著免疫次數的增加不斷上升，抗血清的抗體滴度達到20000.兔抗mZP2抗血清分別孵育小鼠卵巢組織切片，卵巢的透明帶區出現了特異性的熒光，熒光強度隨血清稀釋倍數增加而減弱，對照的普通血清則沒有出現熒光反應，說明抗血清含與卵透明帶特異結合的抗體。提示表達的ZP2重組蛋白有免疫原性，已誘發產生了抗ZP2抗體，獲得滿意的免疫效果，為下一步ZP2的功能研究打下了基礎。

經典理論認為，ZP2是第二精子受體，能與頂體反應后的精子結合[16].我們的預實驗也顯示，該抗血清孵育小鼠卵細胞后，對精卵結合沒有明顯影響。但用孕酮誘導頂體反應后的精子分別與對照兔血清和兔抗mZP2抗血清孵育后的卵子共培養后兩組結合AR精子數出現了明顯差異，孵育抗ZP2抗體組的卵子平均每個卵子結合AR精子明顯少于孵育對照血清的卵子平均每個卵子結合AR精子數（表1,圖5），說明抗ZP2抗體減少卵子結合頂體反應后精子的數量。

但是，抗血清孵育卵子后，沒能完成阻止誘導頂體反應后的精子與卵子結合，也即孵育抗ZP2抗體后的卵子仍能結合相當數量的精子，有悖于ZP2次級精子受體的特性?？赡苡袃煞矫娴脑?，一是用孕酮誘導精子頂體反應的效率不是很高[17],還有很大一部分精子未發生頂體反應，這部分精子可能不受抗ZP2為抗體的影響繼續與卵子結合；二是與精子結合的位點不完全在ZP2的多肽鏈上，還可能有糖基參與結合精子[18],因此這部分位點不能被抗ZP2肽抗體阻斷，繼續與精子結合。但是，總的看來，抗ZP2抗血清孵育的卵子結合誘導頂體反應后的精子數有明顯減少，幾個批次的結果顯示差異有統計學意義。說明抗血清有抗ZP2抗體的特性，重組ZP2 蛋白誘發了抗 ZP2 抗體，可以用于后續的進一步研究。