百合\\(Lilium spp.\\)是世界著名切花之一，具有很高的觀賞價值，一直深受人們喜愛，是重要的商品花卉和園林綠化植物。自Robb首次離體培養百合鱗莖以來，組織培養技術在百合上的應用已取得了顯著的進展，但百合種類繁多，類型各異，目前很多品種尚未形成規?；a。組織培養技術可有效地進行百合的快速繁殖和脫毒苗生產，是提供生產用百合種球的重要途徑。百合再生能力比較強，許多器官、組織可作為外植體進行離體培養，如鱗片、葉片、珠芽、花器官、種子、胚等[1–9]。關于百合組織培養的研究主要集中在不同培養途徑的外植體材料、培養方式、培養條件、植物生長調節劑種類及質量濃度篩選等方面[2]。由于百合的種、品種、品系間的基因型存在差異，所以，百合誘導分化階段的差異仍需探索。在百合繼代增殖階段，最常使用的植物生長調節劑是0.1~0.5 mg/L的NAA和0.5~2.0 mg/L的6–BA。從前人的研究中可以看出，不同基因型百合對這兩類激素具有較寬的適應范圍。如果能針對幾種百合建立一致的繼代增殖體系，在生產中可起到快速提高組培苗增殖系數、減少工作量、節約成本的作用。試管鱗莖培養是百合種球培育的關鍵技術環節之一。組培苗繼代培養多次后容易出現鱗莖發育慢、葉根長勢柔弱的現象，嚴重影響百合的移栽成活。通過建立促進鱗莖膨大的技術體系，能迅速增加鱗莖的重量，有效促進壯苗，去除病毒，提高移栽成活率，實現短時間內獲得大量生產用優質種球的目標。新鐵炮百合\\(Lilium ×formolongi Hort.\\) 是 由 高 砂 百 合 \\(L. formosanumWalla.\\)與鐵炮百合\\(L. longiflorum Thunb.\\)為親本雜交所得的子代與鐵炮百合回交培育而成的雜種系列[10]，其主要特點是生育期較短，花大瓣厚，花型獨特，花期較長，是優良的切花品種；東方百合‘索邦’\\(L. oriental ‘Sorbonne’\\)花型優美，芳香宜人，是目前市場上最暢銷的切花百合品種之一；野生淡黃花百合\\(L. sulphureum Baker\\)耐陰，耐熱，抗病蟲害，集食用、藥用、觀賞于一身，是培育百合新品種的優良種質材料。本研究中以上述3種不同基因型百合為材料，在前人研究的基礎上對其組培快繁體系進行比較和優化，旨在探索一套促進百合誘導分化、繼代增殖和鱗莖膨大的綜合技術，為百合種球的商業化生產提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為淡黃花百合\\(L. sulphureum Baker\\)的成熟果實和新鐵炮百合‘雷山3號’\\( L. formolongi‘Raizan 3’\\)及東方百合‘索邦’\\(L. Oriental ‘Sorbonne’\\)的種球。

試驗所用基本培養基均為MS培養基，其中含6.5 g/L 瓊脂粉和30 g/L蔗糖，并附加了不同質量濃度的植物生長調節劑6–BA、NAA。培養基的pH值為5.85。培養基在121 ℃高溫下滅菌20 min。培養條件：溫度25 ℃，光照強度2 000 lx，每天光照時間12 h，相對空氣濕度70%～80%。

1.2 方 法

1.2.1 3 種百合種子和鱗片的誘導培養

以顆粒飽滿的種子和干凈無病蟲害的鱗片為外植體。將外植體用洗潔劑浸泡10 min，在流水下用輕柔毛刷刷洗。在超凈臺中，將種子、鱗片放入75%的乙醇中浸泡1 min后，用質量分數25%的次氯酸鈉分別處理15、25 min，之后用無菌水清洗。淡黃花百合種子接入添加不同質量濃度\\(30、60、90g/L\\)蔗糖和不同質量濃度\\(0.001、0.010、0.100 mg/L\\)NAA的MS培養基中；新鐵炮百合‘雷山3號’、‘索邦’鱗 片 接 種 到 含 不 同 質 量 濃 度 \\(0.1 、 0.2 、 0.5mg/L\\)NAA和不同質量濃度\\(0.5、1.0、2.0 mg/L\\)6–BA的MS培養基中，其中蔗糖質量濃度為30 g/L。每處理接30個外植體，3次重復，分別在接入30、40 d 后統計不同處理下鱗片的不定芽誘導率和種子的萌發率。

不定芽誘導率=產生不定芽的外植體數/未發生污染的外植體總數。

平均出芽數=分化的不定芽總數/未污染的鱗片總個數。

萌發率=萌發出苗的種子數/未發生污染的試驗種子總數。

1.2.2 3 種百合繼代增殖培養基的篩選

將淡黃花百合、新鐵炮百合‘雷山3號’和‘索邦’的組培幼苗分別接種到添加不同質量濃度\\(0.1、0.2、0.5 mg/L\\)NAA和不同質量濃度\\(0.5、1.0、2.0 mg/L\\)6–BA的MS培養基中進行增殖培養。每處理接種30株無菌苗，3次重復，接入50 d后統計不同生長調節劑質量濃度處理下組培苗的增殖系數與生長情況。增殖系數=培養后組培苗總數/初始組培苗數。

1.2.3 ‘索邦’組培苗鱗莖的增大培養

為提高百合組培苗的鱗莖質量，促進鱗莖膨大，縮短種球的繁育時間，本試驗中以‘索邦’為例，在前人研究的基礎上，探討高質量濃度蔗糖條件下影響鱗莖膨大的3個主要因素，以期篩選出協同蔗糖高效增加鱗莖鮮重的組合。選取小鱗莖大小相近、整齊一致的組培苗，將MS培養基中大量元素的含量增加1倍、增加2倍\\(分別記為2MS、3MS\\)，配合不同質量濃度的活性炭\\(AC\\)和多效唑\\(PP333\\)進行正交試驗\\(表1\\)，將組培苗切去葉片和根，稱量小鱗莖，再將小鱗莖接入到不同處理的MS培養基中\\(所有處理蔗糖含量均為80 g/L\\)。每處理接30個小鱗莖，3次重復。接入60 d后切去葉片和根，稱量每個鱗莖的鮮重\\(取平均值\\)，統計不同處理下小鱗莖的增大倍數與生長情況。鱗莖增大倍數=培養后鱗莖鮮重/初始鱗莖鮮重。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2010和IBM SPSS 19對數據進行方差分析和因素內多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同配比蔗糖和 NAA 對淡黃花百合種子萌發的影響

由圖1和表2可見，大部分種子都能萌發，且在不同培養基條件下存在萌發快慢和生長勢的差別；幼苗鱗莖大多高度分化，在母體鱗莖長出2~4個子鱗莖，經過60 d左右的培養后子鱗莖與母體鱗莖大小差不多；蔗糖\\(F0.01=6.01<9.104**\\)和NAA\\(F0.01=6.01<17.862**\\)對種子萌發率的影響極顯著；蔗糖和NAA質量濃度分別為60、0.01 mg/L時種子萌發率最高，所以，認為淡黃花百合種子萌發的適宜培養基配方為MS+0.01 mg/LNAA+60 g/L蔗糖。

由圖1和表2可見，培養60 d后，有少量種子沒有萌發，在更換新培養基的同時采取剝皮的處理，發現剝皮后萌發迅速而整齊，剝皮20 d后幾乎100%能萌發，而未進行剝皮處理的只有少量萌發，由此可見，種子的外種皮也是影響其萌發快慢的主要因素。

2.2 不同配比 NAA 和 6–BA 對新鐵炮百合‘雷山 3號’與‘索邦’鱗片誘導分化不定芽的影響

百合的鱗片分化以2種方式進行：一是先形成愈傷組織，然后從愈傷組織上產生不定芽；二是不經愈傷直接產生不定芽。圖2結果表明，試驗中只有少量鱗片產生了愈傷組織，且幾天后愈傷組織便分化出芽點；大部分鱗片則表現為直接產生不定芽或小鱗莖。

雷山3號’與‘索邦’在分化方面具有顯著差異，‘雷山3號’較‘索邦’分化快，每塊鱗片的平均出芽數多，不定芽長勢快，且多是以叢生芽的形式快速生長；‘索邦’在大部分培養基中都是以單芽的形式直接生長成小鱗莖。隨著6–BA質量濃度的增加，不定芽誘導率以及每塊鱗片的平均出芽數逐漸增加\\(表3\\)。經比較，‘雷山3號’在MS+0.5 mg/L 6–BA+0.2 mg/L NAA上培養鱗片的不定芽誘導率最高，可達\\(83.55±5.45\\)%，且平均每塊鱗片出芽數較多，為6.19±0.60；‘索邦’在培養基MS+2.0 mg/L6–BA + 0.3 mg/LNAA上鱗片的不定芽誘導率和平均每塊鱗片的出芽數最高，分別為\\(65.96±5.84\\)%和4.53±0.89。

2.3 不同配比 NAA 和 6–BA 對 3 種百合繼代增殖培養的影響

由表4可見，在淡黃花百合繼代增殖過程中，6–BA\\(F0.05=3.55<5.659\\)和NAA \\(F0.05=3.55<4.592\\)對增殖系數的影響顯著，不同配比6–BA和NAA處理間存在明顯差異；對淡黃花百合組培苗而言，6–BA和NAA的質量濃度分別為2.0、0.2 mg/L時的增殖效果較好。在‘雷山3號’和‘索邦’的繼代增殖過程中，NAA \\(F0.05=3.55>0.842，0.105\\)對增殖系數的影響均沒有統計學意義，而6–BA\\(F0.05=3.55< 26.148 ，12.925\\) 對增殖系數的影響顯著，不同質量濃度6–BA處理間存在顯著差異，2.0 mg/L 6–BA對‘雷山3號’和‘索邦’組培苗的增殖效果較好，因此，認為淡黃花繼代增殖的適宜培養基為MS+2.0 mg/L6–BA+0.2 mg/L NAA，新鐵炮‘雷山3號’與‘索邦’繼代增殖的適宜培養基分別為MS+2.0 mg/L 6–BA+\\(0.1~0.5\\) mg/L NAA ，由此篩選出 MS+2.0 mg/L6–BA+0.2 mg/L NAA為3種百合繼代增殖的適宜培養基。

2.4 ‘索邦’組培苗鱗莖增大培養基的優化

試驗結果表明，‘索邦’組培苗接入9種不同處理的培養基后，大部分生長狀態良好，葉片較少，鱗莖較綠，根系多而粗壯，但也出現少量鱗莖生長畸形的情況，這可能是由于培養基內滲透壓過高引起的。培養50 d后\\(圖2\\)鱗莖膨大倍數\\(表5\\)的極差分析結果表明：各因素對鱗莖增大的影響效應由大到小排列依次為PP333、AC、大量元素，經正交試驗篩選出的最優生長調節劑組合為A3B1C2，PP333對鱗莖增大的影響極顯著\\(F0.01=6.01<8.656**\\)，AC \\(F0.05=3.55>0.697\\)和大量元素\\(F0.05=3.55>0.864\\)的影響無統計學差異，不同質量濃度PP333處理間存在顯著性差異，PP333質量濃度為3.0 mg/L 時鱗莖增大倍數最高，因此，3MS+0.5 g/L AC+3.0 mg/L PP333+80 g/L蔗糖為‘索邦’無菌苗鱗莖增大的適宜培養基。

3 結論與討論

在淡黃花百合種子萌發試驗中，有少量的組培苗出現胚根向上和葉片貼著培養基生長的現象。生長素的極性運輸及其造成的生長素側向質量濃度梯度是向地性所必需的[11]。本試驗中發現淡黃花百合組培苗的胚根向上而子葉向下生長，與向地性完全相反，這種負向地性生長的現象可能是受生長調節劑影響的結果，有待于進一步研究。另外，培養基中的糖含量是百合幼胚在離體條件下正常生長的關鍵因子[12]。淡黃花百合種子在高濃度蔗糖和低濃度NAA條件下的萌發率較高，鱗莖生長壯實，能迅速成苗，且母體鱗莖周圍新生出較多的子鱗莖。

值得一提的是，在種子萌發生長過程中，約有5%的幼苗根系肥大粗壯，周圍出現質地堅硬的黃綠色顆粒狀愈傷組織\\(有研究者將其定義為“瘤狀根”[13]\\)，這可能是由于培養基中生長素作用的結果。根系周圍的愈傷組織有可能導致輸導組織不暢，影響組培苗生長和移栽成活率，必須及時切除。

植物生長調節劑種類和濃度是影響組織培養中細胞分化與形態建成的關鍵因子，合適的生長調節劑配比可使不定芽分化大大加快，在短期內可繁殖出大量組培苗。王剛等[14]的研究表明，6–BA與NAA的濃度比介于5∶1到10∶1之間時不定芽誘導率較高。本研究中低質量濃度的NAA和高質量濃度的6–BA配合使用可以快速誘導鱗片產生不定芽，且平均每塊鱗片的不定芽數較多。本試驗中3種不同基因型的百合采用相同的培養基配方進行擴繁，均可獲得較高的增殖系數，但篩選出的繼代培養的培養基配方是否適宜多種百合，還需進一步驗證。

影響百合鱗莖形成和膨大的因素是多方面的，如生長調節劑的種類和濃度以及蔗糖、大量元素、活性炭\\(AC\\)、水楊酸、光照、溫度等[15–16]，其中，高濃度蔗糖是促進鱗莖膨大的決定性因素。本研究中在培養基中加入高濃度的蔗糖后，又設置了不同濃度的大量元素、活性炭和多效唑，試圖探索出能夠協同蔗糖高效增加鱗莖鮮重的組合。加倍的大量元素可以為鱗莖生長提供充足的營養物質，活性炭\\(AC\\)可以吸附離體培養中的抑制生長物，并且給鱗莖生長創造暗環境，有利于鱗莖膨大；多效唑\\(PP333\\)是一種生長延緩調節劑，可使植株矮小、莖粗、葉厚，生產上常用于壯苗。本試驗初步研究了不同濃度的大量元素、AC、PP333對于鱗莖增大的影響，至于大量元素、AC、PP333協同高濃度蔗糖綜合影響內源激素的變化，進而促進鱗莖生長的機理有待研究。本試驗中篩選出3.0 mg/L PP333較適宜鱗莖增大。張永平等[16]篩選出15 mg/L PP333對‘索邦’鱗莖增大的效果最好，但本研究預試驗中發現當PP333質量濃度超過10 mg/L 時部分小鱗莖生長變慢，鱗莖質量變差，散心現象嚴重并出現死亡，因此，宜將PP333質量濃度設置在10 mg/L以下。這種差異可能是由于小鱗莖生理、生化狀態不同引起的。

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