大白菜 \\(Brassica Campestris L． ssp． PekinensisOlsson\\) 隸屬于十字花科 \\(Brassicaceae \\) 蕓薹屬\\(Brassica\\) 中的一種葉用蔬菜，是一種具有中國特色的植物，有 “蔬菜之王”的美稱，深受人們的喜愛; 它原產地為地中海沿岸和中國，長江以南為主要產區; 由于中國蕓薹屬植物大白菜的種質資源復雜，以及起源、演化和種類擴散等原因，使中國大白菜個別種類出現同物異名、異物同名的現象，為菜農們對優良品種的選育帶來了不便; 此外，個別品種的大白菜由于生長期較長，需要的生長條件較為復雜，在實踐中已經被淘汰; 過去的一些地方品種已經被雜交種取代，雖有個別地方種仍在種植，但由于產量低，抗病力差，也逐漸在被淘汰;更有一些地方種在長期的生產實踐中要么丟失了、要么已經名存實亡，失去原有的種質特征［1］。所以，為了更能利用現有資源，選育更優良基因品種用于生產實踐，具有重要的理論和實踐意義。文章對大白菜種類進行親緣關系分析，運用改進的 CTAB法提取高質量的大白菜基因組 DNA，以 RAPD 分子遺傳標記法得出數據，利用 NTsys 2． 10e 軟件進行聚類分析，得出七種大白菜的相似系數及樹狀圖［2］。聚類分析是通過數據的形式建模從而簡化數據的方法。它分析簡單而且直觀，主要針對探究性的研究?，F今，聚類分析的涉及領域有很多，主要包括數學、統計學、經濟學、醫療信息處理和生物學等。目前聚類分析獲取了很多優秀成果，如:

基因表達序列分析技術。本實驗利用的是聚類方法是層次聚類，能夠將物種多態性及親緣關系進行聚類分析，得到其樹狀圖和相似系數。

1 材料與方法

1． 1 試驗材料

北京新 3 號; 91 － 12 白菜; 韓國黃心白菜;秋寶白菜; 秋綠 60 白菜; 豐抗 90 白菜; 青雜三號。 \\(材料來自遼寧省新民市春碩種植專業合作社\\)

1． 2 試驗儀器

高速冷凍離心機 \\(上海安亭科學儀器廠，GL－ 20G － IT\\) ; PCR 儀 \\(MG96G，杭州朗基科學儀器有限公司\\) ; 低溫冰箱 \\(青島海爾股份有限公司，BCD －216TMZL\\) ; 紫外分光光度計: \\(T6 新世紀，北京普析通用儀器有限責任公司\\) ; 凝膠成像系統、電泳儀器。

1． 3 試驗藥品

2% CTAB 提取液; β － 疏基乙醇; 10 × PCRbuffer、DNA Marker、dNTPs、28 條引物、高溫 Taq酶、DNA 模板; Nacl; 無水乙醇; 75% 冰乙醇;TE 緩沖液; 液氮等。

1． 4 試驗方法

1． 4． 1 大白菜基因組 DNA 的提取步驟

預熱1 mL 2% CTAB 緩沖液于1． 5 mL 離心管，預熱的條件為 65 ℃，20 min。將七種大白菜幼嫩葉子分別稱取2 g 進行液氮研磨。分別放入1． 5 mL的離心管里并加入400 μL 5μL/mL 的 β － 巰基乙醇和預熱的 2%CTAB 提取液［2］。將其放入 65 ℃下水浴至少 60 min，用冷凍離心機在 4 ℃ 離心 12 000rmp 10 min［3］。將上述七個離心管離心后去掉上清液，分別加入等體積的氯仿: 異戊醇重復抽提，用冷凍離心機離心，4 ℃離心 12 000 rmp 10 min。將離心過后的上清夜放入另一個同樣等大的離心管中并分別加入 75%乙醇 \\(預冷\\) ，可出現白色絮狀沉淀 \\(即 DNA \\) 。用冷凍離心機在 4 ℃ 離 心12 000rmp 10min。將七個離心管上清液倒出，進行 10 min 的干燥后加入 TE 緩沖液 \\(100 μg/mL\\) 。

基因組 DNA 溶解完全后向七個離心管中分別加入50 μL / mL RNase \\(37 ℃ 消化 60 min\\) 。在七個離心管中加入 400 μL 異丙醇及 1/10 的 100 μL 5 mol/LNaCl 溶液，在低溫冰箱中 － 20 ℃ 保溫至少 20 min以上。用 75%的乙醇 \\(預冷\\) 反復洗滌，充分去除雜質，無水乙醇漂洗 1 次。待提取的大白菜基因組 DNA 風干后，再分別向七個離心管內加入適量TE 緩沖液溶解基因組 DNA，作為 DNA 原液。置于－ 20 ℃ 保存。

1． 4． 2 大白菜基因組 DNA 的純度及完整性檢測

1． 4． 2． 1 大白菜基因組 DNA 純度測定

將上述的 DNA 原液取其 20 μL，加入 180 μLTE 緩沖液，離心、放在比色皿中，用紫外分光光度計進行比色。以 200 μL TE 緩沖液作為參照，在260 nm 和 280 nm 波長處分別進行比色。 計算A260 / A280 數值，作為基因組 DNA 純度［4 －7］。

1． 4． 2． 2 大白菜基因組 DNA 完整度測定

制備 1%瓊脂糖凝膠，七種大白菜基因組 DNA樣品: EB 按 5∶ 1 的比例。Maker: EB 按 1∶ 1 混合的比例。將其混合液用移液槍打入孔內。電泳: 條件電壓 100 V。觀察: 將混合樣品在凝膠系統下進行觀察并記錄。

1． 4． 3 PCR － RAPD 反應體系的建立

有效引物的篩選: 將提取出的七種大白菜基因組 DNA 加入 DNA 池中，用隨機 28 條引物分別進行七種大白菜基因組 DNA 的 PCR 擴增，之后進行電泳，凝膠成像系統進行觀察，圖像中出現條帶的片段，所用的引物為有效引物。

PCR 擴增的反應體系:反應進行的總體積為 25μL: Taq 酶 2． 5 U/μL; 10 × PCR Buffer; 模板 DNA 50 ng /μL; 28 條引物 \\(上海生工生物工程公司\\) 。dNTPs 0． 2 mmol/L 度、Mg2 +1． 5 mmol / L．

1． 4． 4 電泳檢測:

1% 瓊脂糖凝膠，5 × TBE 電泳緩沖液。電泳條件: 100 V 電壓，在凝膠成像系統下觀察、拍照并記錄。

1． 4． 5 數據分析:

RAPD 多態性條帶統計: 引物與模板 DNA 互補的結合位點均代表了電泳圖譜中的每個條帶，即稱為一個分子標記; 每次反應重復 3 次，以條帶清晰，重復出現 2 次或 2 次以上的條帶為記錄對象。

按照電泳圖譜，全部材料再同一位點 RAPD － PCR反應出現電泳條帶的記為 1，沒有出現電泳條帶出現的記為 0，最后以 0/1 矩陣模型在 Excel 表格輸入電腦的使用［11 －15］。

多態性帶比率: 在一個特定的分子標記上，如果電泳條帶出現的頻率小于 0． 99，那么此條帶便視為具有多態性的條帶，即多態性帶。 \\(P: 多態性帶比率; K: 多態性帶; N: 擴增出的總條帶數\\)P = \\(K / N\\) × 100%RAPD 相似系數: F: 相似系數; NXY: 兩個群體或者兩個個體之間共同具有的 RAPD － PCR 分子標記數; NX: X 群體或者個體具有的 RAPD － PCR分子標記數; NY: Y 個體或者群體具有的 RAPD 分子標記數。\\(出自 Nei 和 Li 的方法\\)F = 2NXY/ NX+ NY數據分析: 使用軟件 NTsys 2． 10e 分析數據，得到相似系數，并繪出聚類圖。

2 結果分析

2． 1 DNA 純度檢測

2． 1． 1 DNA 純度和產量

實驗采用改進的 CTAB 法，分別對七種大白菜進行基因組 DNA 提取，存于 TE 溶液或者去離子水中，并用紫外分光光度計檢測吸光值，上述步驟要重復 3 次，取效果最好的結果進行記錄并計算，結果可知 OD260/ OD280 的范疇在 1． 796 ～ 2． 031 之間\\(如表 1\\) ，說明提取的七種大白菜基因組 DNA 幾乎沒有蛋白質雜質污染，其純度可以滿足 RAPD 分析的需求。

2． 1． 2 瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 純度

通過凝膠成像系統觀察七種大白菜基因組DNA 樣品 \\(如圖 1 \\) ，可看出各種大白菜基因組DNA 樣品主帶較為清晰，完整性較好，遷移率較低，點樣孔中無蛋白質 － DNA 混合物滯留，但具有少量的 RNA 存在。注: \\(M: Maker; 1: 北京新3 號; 2: 91 － 12 白菜; 3: 韓國黃心白菜; 4: 秋:

寶白菜; 5: 秋綠 60 白菜; 6: 豐抗 90 白菜; 7:青雜三號\\)

2． 2 引物篩選

實驗選取秋寶白菜和豐抗 90 白菜兩種具有代表性的白菜為模板，以從上海生物工程有限公司合成的 28 條 S 系列的引物進行篩選，有的隨機引物對七種大白菜基因組 DNA 樣品均不能產生擴增條帶，有的隨機引物產生的條帶較弱不清晰且只對部分種類產生條帶，所以，實驗反復 3 次，選用條帶清晰，多態性較好且穩定重復的 5 個引物，來進行七種大白菜基因組 DNA 樣品的 RAPD 分析。篩選出的引物分別為 S25，S183，S197，S206和 S1026。

2． 3 RAPD 反應體系的分析

2． 3． 1 大白菜基因組 DNA 擴增條帶的多態性分析

實驗利用所篩選出的 5 條引物，對 7 種大白菜基因組 DNA 樣品就行擴增，每條引物均反復擴增三次，選取條帶清晰，并穩定重復出現的條帶為統計對象。結果表明，5 條引物在七種大白菜基因組DNA 樣品中共擴增出 67 條條帶清晰且重復性好的DNA 帶，其中有 41 條具有多態性，多態性比率為61． 2% ，呈現出較為豐富的多態性。平均每條引物產生13． 4 條 DNA 帶，和8． 2 條具有多態性的 DNA帶。不同引物擴增出的總帶數和多態性帶數有明顯差異，其中擴增條帶數較多的引物分別是 S183和S1025; S1025擴增條帶的多態性比率較高 86． 7%，S197擴增條帶的多態性比率較低 30． 8% \\(如表 2\\) 。

擴增圖譜如下:

2． 4 聚類分析

2． 4． 1 相似系數分析

使用 NTsys 2． 10e 軟件，利用 RAPD － PCR 進行分析所得的數據，進行聚類分析，得到了七種大白菜各樣品之間的遺傳相似系數，建立 UPGMA 聚類圖。遺傳相似系數越高，每個樣品之間的關系密切。由分析數據可得，七種大白菜的相似系數介于0． 4 ～ 0． 8 之間，即得平均相似系數為 0． 6; 北京新3 號、秋綠 60 白菜和豐抗 90 白菜三種大白菜的親緣關系較近，可達到 0． 8，由此可推斷三者之間可能具有同源性，屬同一品種 \\(如表 3\\) 。

2． 4． 2 樹狀圖分析

圖 7 為七種大白菜的遺傳品種親緣關系樹狀圖，各樣品的相似系數均小于 1，并且 7 種樣品又都能聚類在一起，說明個樣品之間具有同源性，但是各種間也具有不同程度的差異。由圖示，可將七種大白菜劃分為兩大類，將聚類圖在 0． 65 處做結合線，得出第一類分別是 C2: 91 － 12 白菜、C3:

韓國黃心白菜、C4: 秋寶白菜和 C7: 青雜三號;將聚類圖在 0． 77 處做結合線，得出第二類分別是C1: 北京新 3 號、C5: 秋綠 60 白菜和 C6: 豐抗 90白菜。

3 結論

在該實驗中對七種大白菜的純度及其引物的篩選進行多次反復的重復實驗，保證實驗結果的準確性及穩定性，最終結果表明提取七種大白菜的OD260 / OD280 的范圍在 1． 796 ～ 2． 031 之間，達到進行 RAPD 分析的標準。在 28 條隨機引物中 S25，S183，S197，S206和 S1025能夠符合大白菜基因組 DNA擴增條帶的多態性分析的需求并從實驗結果中可以看出: 7 種大白菜基因組 DNA 樣品多態性比率為61． 2% ，其中 S183和 S1025; S1025擴增條帶的多態性比率的較高，而 S197擴增多態性比率較低。利用RAPD 分子標記進行的遺傳相似系數研究中可以看出各類大白菜的遺傳相似系數都小于 1，第二類C1: 北京新 3 號、C5: 秋綠 60 白菜和 C6: 豐抗 90白菜親緣關系較近，可能屬于同一品種。而第一類C2: 91 － 12 白菜、C3: 韓國黃心白菜、C4: 秋寶白菜和 C7: 青雜三號多態性遺傳差異較大。從研究結果的遺傳相似系數可以看出遺傳多樣性與品種和地域的差異有著一定的關系。

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