體外動物細胞培養已廣泛應用于現代醫學、生物學和分子遺傳學等多個領域，是從事細胞水平及分子水平研究所采用的基本方法。在高原環境下心肌細胞的體外培養尚未見報道。本文擬通過心肌細胞系的體外培養，觀察其生長和增殖狀況，并通過繪制生長曲線，初步探討在高原體外培養動物心肌細胞的可行性和細胞的生長特性，為高原病研究提供實驗基礎。
1 材料方法
1.1 研究對象
心肌細胞系H9C2\\(吉林大學一院轉化研究院惠贈\\)。
1.2 主要儀器及試劑
-80℃低溫冰箱（Thermo），臺式離心機\\(德國\\)；CO2培養箱\\(Thermo\\)、恒溫水浴箱（上海），倒置相差顯微鏡（OLYMPUS）；高糖DMEM培養基、臺盼藍\\(Gibco\\)、CCK8\\(碧云天）。
1.3 細胞復蘇
從-80℃冰箱內取出凍存管，立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化；無菌條件下將細胞懸液移入10ml離心管，緩慢加入無血清培養基至10ml，離心（1000r/min，5min），棄上清，重復1次；血清體積分數為0.15的高糖DMEM培養基混沉淀細胞，制成細胞懸液，調整細胞濃度1×108后接種于33mm 塑料培養皿內，放置于59%CO237℃培養箱中培養。
1.4 心肌細胞成活率計算
細胞培養24h后制備單細胞懸液；采用臺盼藍染色法對活細胞計數。細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9:1混合混勻；在三分鐘內，分別計數活細胞和死細胞；活細胞率（%）=活細胞總數/（活細胞總數+死細胞總數）×100%。
1.5 心肌細胞形態學觀察
采用倒置相差顯微鏡觀察培養細胞形態,了解心肌細胞系生長及增殖情況。細胞接種24h內，每8h觀察培養細胞1次，以后為每天早晚各觀察培養細胞1次。
1.6 細胞計數和生長曲線法檢測細胞增殖
細胞接種當天計為0d，在培養的1-15d間每天下午16點取3塊平皿的細胞用血球計數板進行細胞計數。
使用CCK8試劑盒檢測細胞增殖情況，調整細胞濃度為1×105后接種于96孔板，每孔加入100μL單細胞懸液，分別在培養的1-15d間，每天取5個孔檢測，檢測時每孔加入10μLCCK8溶液，細胞培養箱內繼續孵育1h，用酶標儀在450nm測定吸光度。
2 結果
2.1 心肌細胞形態觀察
心肌細胞最初接種時呈圓形，24h后細胞貼壁生長；4d后細胞有偽足伸出，細胞呈梭形、多角形等形態，大小均勻，生長迅速，7d后細胞逐漸形成細胞簇，11d天后細胞簇相互連接成片生長，融合率達90%時進行傳代。
2.2 心肌細胞存活率
光學顯微鏡下觀察，死細胞被染成明顯的藍色，而活細胞拒染呈無色透明狀；計數1000個細胞，藍染細胞48個，成活率為95.20%。
2.3 細胞增殖能力
在心肌細胞體外培養的不同時間點，采用CCK8法繪制生長曲線，從圖中可見0-1d天內曲線呈現下降趨勢，1-7d曲線平緩上升，7-11d曲線急劇上升，11d后曲線逐漸變得平直且有下降趨勢。心肌細胞隨培養時間延長，數量不斷增加，在第5d時細胞數較第1d時增加了3倍，第7d時細胞再次倍增之后細胞進入快速生長時期到第11d時細胞數達到頂峰，以后進入平臺期（見表1）?！颈?】
3 討論
目前我國對高原病細胞水平的研究主要側重于非高原地區模擬低氧條件的研究。模擬的低氧條件與高原現場環境有很大的差異，例如缺氧持續的時間、全天內不同時段氧分壓的細微改變、不同季節氧分壓的變化以及溫度、濕度等情況都是難以模擬的，所以在高原現場開展細胞水平、分子水平的研究對深入探討高原病的發病和病理機制較模擬條件下研究更有意義且更加有助于對疾病的認識。
本研究在西藏大學高原醫學實驗中心完成。采用單一樣本觀察的方法對高原環境體外培養的心肌細胞生長特性進行研究。一般來講體外培養細胞的生長過程分為潛伏期、對數生長期和平臺期三個階段,本研究中結果顯示，心肌細胞在高原條件下的生長曲線也分為三個階段，第一階段為潛伏期，該時間段正是細胞處在損傷修復、環境適應和貼壁等過程，所以“生長曲線”從初接種的0d時有下降表現，1d時“生長曲線”趨于平緩，2d時“生長曲線”有上升趨勢；從第3d起可見曲線逐步上升說明細胞進入了快速生長期即第二階段對數生長期，在這一階段細胞活力旺盛、增殖活躍、數量倍增明顯；隨著時間的進一步推移從第11d開始曲線逐漸變得平直且有下降趨勢即進入第三階段平臺期，這一階段細胞數量基本維持在恒定水平。從以上三個階段可以看出高原現場進行細胞培養較以往文獻報道的非高原環境培養細胞所需的時間長且細胞生長的各個時段也較非高原地區要長，推斷這一現象可能與高原低壓低氧有關。培養的第4d細胞數較第2d時增加了1倍，但是此后細胞數目增加緩慢，這表明隨著培養時間的延長和細胞數不斷地增加，培養基中的營養成份有所不足，可能是由于細胞量的增加導致代謝產物增多，使細胞營養供應不足，我們給細胞更換培養基1d后，細胞數量又出現了快速增長。以此為依據確定了每間隔3d更換一次培養基的操作方法。從細胞數量變化上我們觀察到在第10d以后細胞增殖變得緩慢，分析其原因可能是隨著細胞的數量的不斷增加導致細胞間相互接觸而使其處于增殖抑制的狀態，我們給細胞進行了傳代處理以后，細胞恢復生長。
高原環境體外培養心肌細胞，營養成分缺乏和接觸抑制作用對細胞增殖是同時存在的影響因素，這與文獻報道是一致的。平均海拔3600米的低壓低氧高原環境可能是心肌細胞生長周期較非高原地區長的一個重要因素。以上結果表明，高原環境可以進行心肌細胞的體外培養，但高原環境使對細胞器和細胞內的蛋白表達是否有影響有待于進一步研究。
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