充質干細胞\\(mesenchymal stem cell,MSC\\) 是再生醫學重要的種子細胞,在許多疾病治療中呈現出令人振奮的治療效果.MSC 首先是由Friedenstein 等[1-2]從骨髓中利用其貼壁生長的特性成功分離出來.這種方法后來被許多研究者用來分離人和實驗動物來源的骨髓 MSC[3-6].小鼠是用量最大、用途最廣、品種最多的實驗動物,已廣泛應用于生物醫學各領域的科學實驗.然而令人煩惱的是實驗者很難成功的從小鼠骨髓分離到高純度的 MSC,或者很難實現 MSC 的連續多次體外傳代擴增培養[7].究其原因,是因為小鼠骨髓量很少,MSC 含量極少,同時混有大量造血細胞的優勢生長,嚴重影響了 MSC 的分離培養[7].研究發現,MSC 存在于許多組織中[8],本研究將嘗試從小鼠骨片中分離 MSC,并建立其分離培養的方法.
材料與方法
一、材料
1. 實驗動物 :C57BL/6 小鼠購自軍事醫學科學院動物實驗中心,雄性,7 d 齡.所有實驗在符合動物實驗倫理要求下進行.
2. 主要試劑及儀器 :αMEM 基礎培養基\\(美國 Gibco 公司\\),胎牛血清\\(美國 Stem cell 公司\\),D-60 mm 細胞培養皿\\(美國 Costar 公司\\),0.2 ﹪膠原酶、β 甘油磷酸鈉、地塞米松、胰島素、1- 甲基 -3 異丁基 - 黃嘌呤、吲哚美辛、維生素 C、油紅O\\(美國 Sigma\\),堿性磷酸酶染色試劑盒\\(美國Sigma\\),胰蛋白酶\\(美國 Amresco 公司\\),PE、FITC或 PERCP 標記抗小鼠單克隆抗體 CD29,CD34,CD45,CD90,Scal1\\(美國 BD 公司\\),CO2培養箱\\(美國 Thermo 公司\\),眼科鑷,眼科剪.
二、方法
1. 小鼠骨片 MSC 分離培養 :C57 小鼠經脫頸處死后,75 ﹪酒精浸泡消毒 10 min.用眼科剪橫向剪開皮膚和肌肉,用眼科鑷撥開露出小鼠脛骨和股骨,剝離脛骨和股骨,從脛骨頭和股骨頭處剪斷,放入預先放有培養基的培養皿中.用 1ml 注射器吸取基礎培養基反復沖洗骨髓腔內的骨髓直至骨片呈白色.將骨片剪碎,加入膠原酶Ⅰ\\(2 mg/ml\\)2 ml,37℃消化 1 ~ 2 h,加入胎牛血清終止消化.加入 αMEM 洗滌骨片,將骨片轉移到新的培養皿中,加入新鮮配制的含胎牛血清 10 ﹪\\(v/v\\)和雙抗 0.1 ﹪\\(v/v\\)的完全培養基,37℃、5 ﹪ CO2培養箱培養 3 ~ 4 d.加入 0.25 ﹪胰酶消化 3 min,收獲 MSC,按 1:3 傳代培養,每2 ~ 3 d 更換培養基 1 次.殘留的骨片可繼續培養獲得更多的原代 MSC.收獲 P2,P3 代細胞進行實驗研究.
2. 流式鑒定 :收獲 P2 代小鼠 MSC,經 PBS洗滌 2 次,加入 PE、FITC 或 PERCP 標記抗小鼠CD29,CD34,CD45,CD90,Scal1 單克隆抗體避光孵育 30 min,加入 PBS 洗滌 2 次,1500 rpm 離心 5 min,重懸細胞,進行流式測定.FlowJ 7.6 軟件進行數據分析.
3. 成 骨 誘 導 分 化 及 鑒 定 :取 P3 代 小 鼠MSC,以每孔 2×104細胞數種植于 24 孔板中,60 ﹪ ~ 70 ﹪融合時,更換為成骨誘導培養基,含胎牛血清 10 ﹪\\(v/v\\),β 甘油磷酸鈉 10 mmol/L,地塞米松 10-7mol/L,維生素 C 50 μmol/L.每 3 ~ 4 d 更換培養基 1 次,誘導 2 ~ 3 周后進行堿性磷酸酶染色鑒定.步驟為吸棄培養基,4 ﹪多聚甲醛固定 30 min,去離子水洗滌 2 次,加入 ALP 染料混合液,室溫孵育 30 min,去離子水洗滌 2 次,每次2 min,加入蘇木素復染 10 min,去離子水洗滌,倒置相差顯微鏡下觀察.
4. 成 脂 誘 導 分 化 及 鑒 定 :取 P3 代 小 鼠MSC,以每孔 2×104細胞數種植于 24 孔板中,60 ﹪ ~ 70 ﹪融合時,更換含胎牛血清 10 ﹪\\(v/v\\),地塞米松 10-6mol/L,胰島素 10 ng/ml,1- 甲基 -3異丁基 - 黃嘌呤 0.5 μmol/L,吲哚美辛 10-4mol/L的成脂誘導培養基,每 3 ~ 4 d 更換培養基 1 次,2 周后進行油紅 O 染色鑒定成脂細胞.步驟為吸棄培養基,PBS 洗滌 1 次,加入 4 ﹪多聚甲醛固定 30 min,70 ﹪異丙醇洗滌 2 次,加入 2 ﹪油紅O 室溫下染色 10 ~ 15 min,棄去油紅 O 染料,異丙醇洗滌殘留油紅 O,倒置顯微鏡下觀察細胞內脂滴.
結 果
1. 小鼠骨片分離清洗 :小鼠脛骨和股骨較小,約 牙 簽 大 小,可 見 骨 腔 內 紅 色 骨 髓\\(圖1 a \\),用 1 m l 注 射 器 吸 取 α M E M 培 養 基 沖洗髓腔骨髓后,顏色變白\\(圖 1b\\).
2. 小鼠骨片 MSC 原代培養 :小鼠骨片培養 2d 后就可以看見骨片邊緣爬出長梭形細胞,3 d 后爬出細胞越來越多,并成集落樣生長\\(圖 2\\).消化細胞進行傳代后,可獲得純度較高的 MSC,并且細胞增殖速度較快,3 d 就可達到 90 ﹪融合.
獲得的 MSC 可以連續傳代數代,仍然保持良好的細胞形態和增殖能力\\(圖 3\\).殘留的骨片還可以繼續作為原代 MSC 的來源繼續培養,經過數次培養后,骨片逐漸疏松,除 MSC 外,殘留骨細胞\\(圖 4\\).
3. 流式鑒定結果 :流式細胞儀結果顯示,獲得的細胞表達 Scal\\(192.7 ﹪\\),CD29\\(98.4 ﹪\\),CD90\\(91.6 ﹪\\)等 MSC 標志物,不表達 CD34\\(1.57 ﹪\\),CD45\\(3.99 ﹪\\),CD11b\\(0.63 ﹪\\)等造血細胞標志物\\(圖 5\\).符合小鼠 MSC 的標準.
4. 向成骨細胞誘導分化結果 :小鼠骨片 MSC經成骨誘導培養基誘導 2 周后,經堿性磷酸酶\\(ALP\\)染色提示細胞內有大量酶顆粒形成,與成骨細胞活性相關的堿性磷酸酶表達陽性\\(圖 6\\).說明獲得的細胞可以成功的誘導分化成骨細胞.
5. 向脂肪細胞誘導分化結果 :獲得的細胞經成脂誘導培養基誘導 4 ~ 5 d 后,倒置相差顯微鏡觀察可見胞漿內出現圓形脂滴,并且隨著誘導時間的延長,脂滴逐漸增多增大.誘導 2 周后,可見大多數細胞內充滿脂滴.經脂肪細胞特異性油紅O 染色,呈紅色油滴樣\\(圖 7\\).證實獲得的細胞可以成功誘導成脂肪細胞.
討 論
MSC 因其具有分化潛能、免疫調控、分泌細胞因子等功能成為再生醫學重要的種子細胞之一.目前已經被廣泛用于多種疾病治療的實驗研究,包括移植物抗宿主病、糖尿病、脊髓損傷、肺和關節疾病等[9].小鼠因其品系純,應用于科學研究中所獲的實驗結果敏感性高,一致性強,重復性高等優點,已被廣泛應用于生物學、醫學、獸醫學、生理學、遺傳學、胚胎發生學等領域的科學實驗.小鼠還具有容易實現基因敲除[10]、體積小、繁殖快、經濟等優點,作為動物模型越來越受到研究者的重視[11].研究者已經采用小鼠成功制作許多人類疾病的動物模型如糖尿病、卵巢癌、肥胖、白內障、創傷、甚至 HIV模型[12]等,為開展干細胞治療疾病的實驗研究提供了重要基礎[11,13-15].然而研究者在采用傳統方法分離小鼠骨髓 MSC 時卻遇到了難題,很難成功的分離高純度的 MSC,或者很難實現在體外長時間繼代培養[7].一些研究者采用大鼠或人源的 MSC 作為供者細胞,替代小鼠來源 MSC來研究治療效果,以解決小鼠 MSC 來源不足的問題.雖然 MSC 的免疫原性很低,但依然不能排除異種來源細胞對實驗研究效果的影響.為避免上述問題對實驗研究的影響,建立能獲得足量、穩定的小鼠來源 MSC 對研究者具有重要意義.
MSC 是骨髓腔中的基質細胞,是構成骨髓造血微環境的重要成分,因此骨實質中可能存在大量的 MSC[16].研究發現,在骨髓腔邊緣或骨實質中還存在更原始的 MSC,表達成熟 MSC 不表達神經干細胞的標志[16].本研究通過清洗骨髓腔內骨髓,去除造血細胞的影響,成功從小鼠骨片中分離出高純度的 MSC,并成功進行體外傳代培養.獲得的細胞高表達 MSC 標志 Scal1,CD29,CD90,不 表 達 造 血 系 統 細 胞 標 志 物 CD11b,CD34,CD45.并具有多向分化的能力,可以成功誘導成脂肪細胞、骨細胞.
所以通過骨片法可以獲得小鼠來源 MSC,并且純度高,增殖能力更強,能夠實現在體外較長時間的繼代培養,為實驗研究提供了很好的種子來源.同時還可以利用許多轉基因小鼠如綠色熒光小鼠等,分離獲得具有特殊功能的 MSC\\(表達綠色熒光\\),以及利用一些基因敲除小鼠獲得某基因缺失的特殊 MSC,為進一步開展實驗研究提供更豐富的種子來源.
參 考 文 獻:
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