支氣管肺發育不良\\(bronchopulmonary dysplasia,BPD\\)是當今威脅早產兒生存質量和遠期預后的主要疾病之一.內質網應激\\(endoplasmic reticulum stress,ERS\\)作為介導細胞適應性生存和凋亡的雙刃劍,已被證實在阻塞性肺疾病、間質性肺疾病、肺癌等多種肺部疾病的發病過程中發揮重要作用[1 -3],但迄今為止有關其在 BPD 發生發展中的作用研究報道甚少.葡萄糖調節蛋白 78\\(glucose regulated protein 78,GRP78\\)是 ERS 的標志蛋白,它的生理意義在于應激狀態下大量表達,在 ERS 早期可維持內質網穩定,減少細胞凋亡發生.鑒于細胞傳代穩定性的要求,本研究選用具有相似生物學特性的 A549 細胞代替肺泡上皮細胞,應用高濃度氧建立 A549 細胞凋亡模型,通過轉染小干擾 RNA \\(small interfering RNA,siRNA\\) 片段特異性沉默內質網應激相關因子 GRP78的表達,觀察 GRP78 在上皮細胞凋亡中的作用及可能機制,為進一步研究 GRP78 在 BPD 中的調控作用奠定基礎.
1 材料和方法
1. 1 材料 A549 人肺腺癌細胞為江蘇大學附屬醫院中心實驗室細胞庫保存.DMEM 培養基購自 Gibco 公司; Opti-MEM低血清培養基、脂質體 LipofectamineTM2000 轉染試劑、逆轉錄試劑盒、TRIzol 均購自 Invitrogen 公司; Real-time PCR 試劑盒購自 TaKaRa 公司; 兔抗大鼠 GRP78 多克隆抗體、兔抗大鼠C / EBP同源蛋白\\(C / EBP homology protein,CHOP\\) 多克隆抗體、兔抗β-actin 抗體、辣根過氧化物酶\\(horseradish peroxidase,HRP\\) 標記的山羊抗兔 IgG 均購自 Abcam 公司; BCA 試劑盒購自碧云天公司; ECL 試劑盒購自 Pierce 公司; annexinV-FITC / PI細胞凋亡檢測試劑盒購自 BD 公司.CYS-1 數字式測氧儀為上海嘉定學聯儀表廠產品.
1. 2 方法
1. 2. 1 siRNA 轉染 根據預實驗篩選出轉染效率最高的GRP78-siRNA 靶序列如下: 正義鏈 5'-AAGAUCACAAUCAC-CAAUGACTT-3', 反 義 鏈 5'-GUCAUUGGUGAUUGUGAUCU-UTT-3',陰性對照 siRNA \\( scramble siRNA \\) 序列: 正義鏈5'-AAAUCAUAGCGUAUGGUGCUGTT-3',反義鏈 5'-CAGCAC-CAUACGCUAUGAUUUTT-3'\\( 上海吉瑪制藥技術有限公司\\) .按試劑說明書操作,選用50 nmol/L siRNA、5 μL LipofectamineTM2000 為每孔細胞的轉染劑量,二者分別用 2 mL 無血清 DMEM稀釋,在30 min 內將已稀釋的 siRNA 和 LipofectamineTM2000 混勻,室溫 20 min,轉染前 24 h 在6 孔板中接種 A549 細胞,加入不含抗生素的適量 DMEM 培養液,細胞達到 60% ~70%匯合度時進行轉染.轉染后在 37℃ 培養箱中培養 8 h,吸除無血清混合液培養基,換入 DMEM 培養基培養 48 h.
1. 2. 2 細胞模型建立及分組 實驗分為高氧空白組、陰性對照\\(陰性 siRNA\\)組和實驗\\(GRP78-siRNA\\)組 3 組,將各組細胞接種于培養瓶內生長.當細胞達到 90% 匯合度時,給予50 mL / L CO2\\(5 L/min\\)10 min,然后迅速用封口膠密封培養瓶,置于 37℃、50 mL/L CO2培養箱中培養.給氧 48 h 后收獲各組細胞,用 CYS-1 數字式測氧儀檢測各培養瓶中氧濃度,將氧濃度低于 900 mL/L 的樣本棄去.A549 細胞 24 h 后更換培養液1 次,換液后重復上述操作給氧.
1. 2. 3 GRP78 和 CHOP mRNA 表達水平檢測 采用實時定量 PCR,按 TRIzol 試劑一步法提取細胞總 RNA,用DNA/RNA測定儀檢測 RNA 濃度和純度,按 M-MLV 逆轉錄試劑盒說明書合成 cDNA 后,進行 PCR 反應.相應引物\\(上海生工公司\\)序列如下: CHOP 上游引物為 5'-CACTCTTGACCCTGCTTC-3',下游引物為 5'-AGTCGCCTCTACTTCCCT-3';β-actin 上游引物為 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3',下游引物為 5'-TGGT-GAAGACGCCAGTGGA-3'.反應條件為 95℃ 預變性 3 min,95℃ 20 s,56℃ 20 s,72℃ 20 s,40 個循環,72℃ 5 min.反應結束得到相應擴增曲線和融解曲線,記錄各樣本 Ct 值,以β-actin 作內參通過 2- △△Ct公式計算 GRP78 和 CHOP mRNA 的表達量.
1. 2. 4 Western blot 法檢測 GRP78 和 CHOP 蛋白的表達 收集各時間點細胞,裂解離心后提取細胞總蛋白,按 BCA 蛋白測定法檢測各組蛋白濃度.在垂直電泳儀中灌入 120 g/L 分離膠和 50 g/L 濃縮膠,按順序在各泳道加入各時間點蛋白樣品 45 μL,經 SDS-PAGE 后,半干式電轉膜,然后 37℃ 封閉1 h,加入兔抗大鼠 GRP78 多克隆抗體 \\( 1 ∶ 200 \\) 、兔抗大鼠CHOP 多克隆抗體\\(1∶500\\) 、兔抗 β-actin 抗體\\(1∶1 000\\),4℃孵育過夜,洗膜后加入相應的 HRP 標記的山羊抗兔 IgG\\(1∶2 000\\)37℃ 孵育 1 h,采用 ECL 增強化學發光顯色系統顯色.用 GDS-8000 型凝膠成像分析系統掃描分析結果,以β-actin的表達水平作內參.
1. 2. 5 細胞凋亡檢測 采用 annexin Ⅴ和 PI 雙染色法.收集各組細胞,按試劑盒說明書操作,PBS 洗滌細胞 2 次,離心后用 1 μg/mL annexin V-FITC 和 PI 標記溶液重懸細胞,37℃避光孵 育 15 min,通 過 流 式 細 胞 儀 檢 測 細 胞 凋 亡,應 用CellQuest 軟件分析結果.
1. 2. 6 統計學分析 應用 SPSS12. 0 統計軟件進行數據統計和分析.計量資料以 x ± s 表示,組間兩樣本均數比較采用t 檢驗.以 P < 0. 05 為差異有統計學意義.
2 結果
2. 1 A549 細胞 GRP78、CHOP mRNA 表達比較各組 GRP78 和 CHOP 基因的對應起峰時間基本一致,無明顯雜峰\\(圖 1\\),將所得 Ct 值通過 2- △△Ct公式計算后行統計學分析,結果顯示,與高氧空白組相比,實驗組細胞 GRP78 mRNA 表達含量顯著降低,CHOP mRNA 表達含量顯著增加,差異有統計學意義\\(P < 0. 05\\); 與實驗組相比,陰性對照組細胞 GRP78mRNA 表達含量顯著增高,CHOP mRNA 表達含量亦顯著降低,差異均有統計學意義\\(P <0. 05,圖 2\\).
2. 2 A549 細胞 GRP78、CHOP 蛋白表達比較 實驗組細胞 GRP78 蛋白表達含量較高氧空白組顯著降低,CHOP 蛋白表達含量較高氧空白組顯著增加,差異有統計學意義\\(P <0. 05\\); 陰性對照組細胞 GRP78蛋白表達含量較實驗組顯著增加,CHOP 蛋白表達含量較實驗組顯著降低,差異有統計學意義\\(P <0. 05,圖 3\\).
2. 3 A549 細胞凋亡率比較 檢測各組 A549 細胞早期凋亡情況，高氧空白組的凋亡率為 34． 3%，實驗組的凋亡率為 47． 6%，與高氧空白組相比差異有統計學意義 \\(P ＜ 0． 05\\)，陰性對照組的凋亡率為38． 6% ，與高氧空白組相比差異無統計學 意 義\\(P ＞ 0． 05，圖 4\\)。
3 討論
BPD 仍是早產兒最常見的嚴重肺部并發癥,目前認為其發病機制主要與圍生期和出生后因素之間復雜的相互作用有關,后者包括機械通氣、氧中毒、感染及炎性損傷[4 - 5].這些因素均可打破內質網的穩態,觸發 ERS,我們前期研究已證實肺組織細胞具備發生 ERS 的條件和基礎[6],此次研究發現體外肺細胞高氧損傷模型中存在 GRP78 基因表達,間接提示 ERS 參與了 BPD 的發病過程.
GRP78 具有兩面性[7],在 ERS 早期,能轉移內質網腔內的錯誤折疊蛋白以保護內質網穩態,是一種防御機制,ERS 過強過久時,GRP78 則成為未折疊蛋白反應的負調節蛋白,最終激活凋亡信號促進細胞凋亡.越來越多的研究[8 - 11]發現調控 GRP78 表達對肝細胞、黑素細胞、結腸上皮細胞、前列腺細胞等多種細胞凋亡起到關鍵作用.He 等[12]通過香煙煙霧提取物誘導慢性阻塞性肺疾病細胞模型實驗表明 GRP78 基因沉默后可上調 caspase-3 表達并增加細胞凋亡率.由此我們猜想干擾 GRP78 基因表達亦可能影響肺損傷引發的凋亡效應.為了解沉默 GRP78表達對高氧誘導肺泡上皮細胞凋亡的可能作用,本研究利用小干擾 RNA 導入法封閉 GRP78 基因表達,并通過檢測 GRP78 mRNA 和蛋白表達水平以觀察沉默效應.結果發現,與高氧空白組、陰性對照組相比,siGRP78 組中 GRP78 mRNA 和蛋白表達水平均明顯降低,這表明 siGRP78 在基因水平上發揮了封閉細胞內源性 GRP78 表達的特異性作用.進一步檢測細胞凋亡發現,實驗組早期細胞凋亡率明顯增加,這驗證了我們的猜想,并提示 siGRP78 下調 GRP78表達同時,也相應減弱了 GRP78 的細胞保護功能,從而加速了 ERS 反應性細胞凋亡.
ERS 通過 CHOP、c-Jun N 末端激酶 \\( c-Jun N-terminal kinase,JNK\\)、caspase-12、Ca2 +等多條信號通路參與細胞凋亡的調控[13 -14],其中 CHOP 是介導ERS 誘導細胞凋亡的特異性轉錄因子,其表達情況可顯著影響細胞的存活.Fan 等[15]研究發現,在卵巢上皮細胞中沉默 GRP78 基因能通過加速 CHOP 激活使細胞對死亡受體介導的凋亡更敏感.這一發現啟示我們進一步檢測肺損傷細胞中 GRP78 基因沉默后 CHOP 的表達情況.結果顯示,siGRP78 組肺泡上皮細胞中 CHOP mRNA 和蛋白表達水平較高氧空白組和陰性對照組均明顯升高,提示沉默 GRP78 表達可上調 CHOP 表達,這在一定程度上促進了 CHOP凋亡通路,誘導凋亡信號轉導和肺泡上皮細胞凋亡.
目前認為 CHOP 凋亡途徑主要與抗凋亡基因 Bcl-2 表達下調、谷胱甘肽減少、活性氧增加等因素有關[16],但 CHOP 通路如何介導細胞凋亡的具體機制仍未闡明.我們猜測應用 CHOP 凋亡途徑中關鍵轉錄因子的抑制劑可能會阻礙高氧誘導的細胞凋亡發生發展.
本研究表明,應用基因沉默技術抑制 GRP78 表達可增強高氧活化的 CHOP 凋亡途徑誘導的肺泡上皮細胞凋亡.如果應用基因過表達技術調控 GRP78表達可能會減少細胞凋亡,這可能對 BPD 的早期治療有積極意義,尚待進一步研究.
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