活性氧（ Reactive oxygen species,ROS） 是一群具有較強氧化能力的分子的總稱[1].生物體內的ROS 包括超氧陰離子（ O2· -） 、羥自由基（ ·OH） 、過氧化氫（ H2O2） 、單線態氧（ O2） .活性氧在免疫系統中主要來源于細胞膜的 NADPH 氧化酶復合體2 （ Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxi-dase,NOX2） ,并在淋巴細胞間的信號轉導發揮巨大作用[2].早在 1980 年人們就認識到 ROS 在固有免疫中作為主要武器對抗病原體的重要作用，現今發現其在不同濃度的情況下在獲得性免疫中的重要調節作用。

1 ROS 的功能

之前的觀點認為 ROS 是一類細胞內毒性物質，到后來從被證明可以激活胞漿內的第二信使鳥苷酸環化酶（ cGMP） 開始，ROS 在細胞信號轉導中發揮的作用越來越受到人們的重視。O2· -是線粒體產生 ROS 的前體，其他形式都是由生物體內各種酶催化 O2· -而來。其中超氧岐化酶（ SOD） 可以催化O2· -轉化為 H2O2.H2O2是 ROS 中最穩定的形式且擴散能力較強，但是據資料顯示它的穩定會受到細胞內的 pH 和氧化還原平衡影響[3].H2O2的強擴散力主要因為它可以自由進出細胞膜，而最近證據表明： 過氧化氫可能通過細胞水通道蛋白優先進入特定的細胞[4].H2O2主要通過氧化多種蛋白質的半胱氨酸殘基（ -SH） 來實現信號轉導。它具有靶向可逆的氧化半胱氨酸的硫化物（ -SH） 為次磺酸（ -SOH） .帶電的氨基酸可以使正常的半胱氨酸殘基 pKa8. 5 降低到 pKa5 以下，這種低 pKa 半胱氨酸可以成為 H2O2的氧化目標。這個發現支持過氧化氫可以作為第二信使[13,14].H2O2可以以模仿配體的方式來激活多種受體信號通路。它可以直接激活部分受體或者激活含有蛋白質酪氨酸激酶（ PTKs） 的通路。另一個通路是抑制蛋白質酪氨酸磷酸酶（ PTPs） 的激活。PTP 主要在受體激活通路的信號傳遞中起抑制作用并且抑制 PTK 的活化。一些像染色體的張力蛋白（ PTEN）和促分裂原活化激酶（ MAPK） 之類的磷酸酶也可以被 H2O2所抑制[5].

2 免疫應答中 ROS 的來源

在有氧呼吸過程中，多數真核細胞都可產生ROS 參與細胞間的轉導。線粒體內膜上的電子傳遞鏈是細胞內 ROS 產生的主要部位。在線粒體內膜呼吸鏈的 5 個復合物中，小部分電子由復合物Ⅰ、復合物Ⅲ漏出，使分子氧還原生成 O2· -.免疫系統中吞噬細胞是最早發現可以產生 ROS,隨著檢驗探測技術的發展，研究者用胞內熒光探針如二氯熒光黃雙乙酸鹽（ DCFH-DA） 、二氫乙啶（ DHE） 、雙氫羅丹明（ DHR） 等，通過流式細胞分析儀檢測單個細胞合成的 ROS 已經證明 T、B 淋巴細胞也能產生 ROS.特別是 T 細胞受體 TCR 活化后的 2 ~ 4 min 就有ROS 產生，這提示 ROS 是 TCR 活化的過程中的潛在作用分子[6].淋巴細胞主要通過細胞質膜上 NADPH 氧化酶復合體 2 產生，而 NADPH 氧化酶復合體 2 缺陷的小鼠 T 細胞 ROS 產生減少并且該小鼠獲得慢性肉芽腫性?。?Chronic granulomatous disease,CGD） ,充分說明 NADPH 氧化酶復合體 2 是免疫系統產生ROS 的重要來源[7].

3 活性氧調控免疫應答的作用及機制

3. 1 活性氧在先天免疫中的作用 早在 1980s 人們就認識到中性粒細胞在病原體入侵機體時可以產生大量的 ROS 來消滅病原體。ROS 在先天免疫應答中不僅對病原體有直接殺傷作用，還可以通過調節 NK 細胞活性來參與一系列抗菌活動。

3. 1. 1 活性氧的抗菌作用 機體遭遇病原體入侵時，中性粒細胞、吞噬細胞“呼吸爆發”產生大量的ROS.由此產生的 ROS 為抵抗病原體的主要武器。缺乏 NADPH 氧化酶復合體 2 的患者先天免疫低下而易患各種感染。雖然 NADPH 氧化酶復合體 2 主要產生超氧化物，但因為其相對于其他形態 ROS 的不活躍性，因此對超氧化物直接殺傷病原體的能力仍然存在爭議[2].反而由于其自身的不穩定性，超氧化物會轉化成其他更穩定的形式。在超氧岐化酶的催化下超氧化物歧化成 H2O2,而 H2O2可以氧化靶蛋白的半胱氨酸殘基或形成二硫化物達到殺傷病原體的目的。H2O2和氯離子 Cl-在髓過氧化物酶的作用下產生次氯酸（ HOCl） .HOCl 和 H2O2可以在局部聚集一定的濃度產生殺菌作用。

然而，最近的研究結果表明，ROS 不僅直接用于殺死病原體，還動員其他抗菌策略。中性粒細胞是人體最多的免疫細胞，它是人體免疫的第一道防線，甚至細胞死亡后可以形成中性粒細胞胞外網狀陷阱（ NETs） .NETs 包括 DNA /組蛋白骨干和抗菌素肽。這些網狀結構可以阻止病菌的擴散，而且來自中性粒細胞顆粒的抗菌蛋白具有殺菌作用。但是有 NADPH 氧化酶復合體 2 缺陷的病人則不能形成這種陷阱說明來源 NADPH 氧化酶復合體 2 的 ROS在這一殺菌機制中有重要的作用[8].

3. 1. 2 活性氧調節自然殺傷細胞的活性 不需要與抗原接觸，NK 細胞是先天免疫系統的主要作用細胞能殺傷惡性細胞和已感染的細胞，并且 NK 細胞通過大量的細胞毒素對癌癥起到免疫監視作用。1980 年的研究揭示了 NK 細胞遇到癌細胞早期會促進 ROS 的產生并且這對 NK 細胞介導的細胞溶解是必需的。來自慢性肉芽腫性病患者的 NK 細胞在缺乏 NADPH 氧化酶復合體 2 的情況下，仍擁有正常的溶解功能，隨后實驗證明可能來自脂氧合酶途徑[6].

有數據證明單核細胞可以抑制 NK 細胞的活化、增殖、IFN-γ 分泌和細胞毒性。而來自慢性肉芽腫性病患者的單核細胞卻不抑制 NK 細胞功能，表明 NADPH 氧化酶復合體 2 產生的 ROS 在此抑制中的主要作用因子[6].組胺與 H2 受體結合可產生解除單核細胞抑制 NK 細胞的作用，而單核細胞自身可以抑制組胺的產生。IL-12 最初可以激活 NK 細胞，但延長 IL-12 的作用會誘導 NK 細胞的凋亡，并降低 NK 細胞的細胞毒性和 IFN-γ 的分泌。數據表明延長 IL-12 的刺激作用會導致 ROS 的聚集，進而使細胞釋放細胞色素 c,而高濃度的 ROS 會抑制 NK細胞的細胞毒性并且誘導凋亡。

3. 2 活性氧在獲得性免疫中作用 ROS 不僅是先天免疫的主要武器，而且從影響抗原提呈細胞的成熟分化到調節 T、B 細胞的活化、增殖、凋亡來調節獲得性免疫。有數據顯示提高胸腺細胞內的 ROS濃度會影響正常 T 細胞的發育而損害哺乳動物的獲得性免疫系統[15].

3. 2. 1 活性氧對抗原提呈細胞的作用 樹突狀細

胞（ Dendritic cell,DC） 是體內最主要的抗原提呈細胞，可以啟動一系列免疫反應。在體內，當受到外源病原體的刺激時，DCs 捕獲大量的抗原并且把它們提呈給 T 細胞去引發抗原特異性免疫應答。當獲得功能性成熟型表型 DCs 將下調他們抗原捕獲能力而上調抗原提呈能力和協同刺激分子的表達。

H2O2可以上調 DC 的 HLA-DQ、DR 分子和協同刺激分子 CD40 和 CD86 的表達，同時下調 CD32 和CD1α 來誘導 DC 的表型和功能成熟，降低 DC 的抗原捕獲能力促進抗原呈遞作用[9].有實驗用蛋白水解酶阻斷 MG-132 預處理 DCs,該物質可以阻斷NF-κB 活性，結果 H2O2對處理后的 DCs 誘導其CD86 上調的作用大大減弱。數據表明 H2O2可以通過 NF-κB 機制來誘導 DCs 的表型和功能的成熟。

同時發現經過 H2O2處理后的 DCs 比正常的 DCs 更能誘導 T 細胞的增殖，該作用可被自由基清除劑 N-乙酰半胱氨酸 NAC 所抑制。相反，有結果也顯示： 膀胱癌患者中的 ROS 可能下調 DC 呈遞腫瘤抗原給 CTL 從而抑制 CTL 對膀胱癌 T-24 的殺傷能力，并且這種抑制作用隨濃度的降低逐漸減弱。目前認為正常的機體處于氧化還原的平衡狀態，機體本身有強大的代償作用。當機體產生 ROS時同時也會產生抗氧化物質。當機體處于急性或慢性炎癥時氧化平衡點可能不同而 ROS 會顯示不同的作用。

3. 2. 2 活性氧對淋巴細胞的作用

3. 2. 2. 1 活性氧激活淋巴細胞 現在已明確 ROS特別是 H2O2能作為第二信使參與淋巴細胞的活化。ROS 能激活 JNK-1 通路從而引起 IL-2 的表達，而 IL-2 是作為 T 淋巴細胞活化的第三信號[6].早期抑制 NADPH 氧化酶復合體 2 來阻斷該來源的ROS 產生會抑制淋巴細胞的活化[20].T 細胞在識別抗原和活化過程中需要和 APC通過免疫突觸緊密接觸。NADPH 氧化酶復合體 2是 APCs 膜的組成成分，并且由脂筏運輸到免疫突觸，在免疫突觸這局部微環境內 O2· -歧化的 H2O2可以聚集足夠的濃度來氧化半胱氨酸，從而激發 T細胞活化通路[17].

蛋白酪氨酸激酶（ PTK） 和蛋白酪氨酸磷酸酶（ PTP） 是淋巴細胞活化和失活的兩大對立的含有半胱氨酸的酶系統，也是 ROS 的主要作用靶點。在抗原和病原體的刺激下，靜息狀態下的 B 細胞活化生成漿細胞并產生抗體。有實驗證明用過礬酸鈉（ PTP 的抑制劑） 取代抗原與 B 細胞孵育，B 細胞會產生更多的抗體。Igα 和 Igβ 尾端都帶有一個含有酪氨酸激活基序（ ITAM） .靜息狀態下 ITAM 被活性 PTP 抑制而在 BCR 的活化中產生的 ROS 可以抑制 PTP 從而解除對 ITAM 的抑制[11].有 3 個 PTK（ Lyn、Syk 和 Btk） 和一個 PTP（ SHP-1） 參與 BCR 的信號轉導。雙磷酸化的 ITAM 允許帶有 SH2 氨基末端的 Syk 和 BCR 相連，這刺激更多的 Syk 激活和產生。SHP-1 則可以抑制 Syk 的活性。

更有實驗證明，ROS 可以通過氧化 PTP 的半胱氨酸殘基使之失活從而解除 PTP 對 ITAM 的抑制，ITAM 活化后可以激活 Syk,Syk 又可以刺激更多的ROS 產生從而放大刺激 BCR 的活化。而在 T 細胞內，ROS 特別是 H2O2抑制 PTP 可以促進細胞內MAPK 的磷酸化來促進 T 細胞的活化[12,14].

3. 2. 2. 2 活性氧與淋巴細胞分化、增殖和信號轉導實驗表明淋巴細胞的分化和增殖伴隨著 ROS 濃度的增加。體外用分裂素刺激 B 淋巴細胞實驗中，最初 2 h ROS 的濃度僅輕度增加，而 24 h 后則增加明顯，伴隨著抗氧化物質的明顯增加[19].ROS 可以直接或間接作用于多種轉錄因子如：p53、jun、Akt 等參與調控 MAPK 和 NF-κB 等信號通路來介導淋巴細胞分化、增殖和信號轉導。MAPKs對氧化還原特別敏感并且與細胞的增殖、分化、凋亡密切相關。該信號系統主要包括細胞外信號調節激酶（ ERK） 、c-JunN 端激酶 JNK 和 P38MAPK 三條途徑。通常 ERK 主要接受生長因子的刺激，活化后激活轉錄因子活化蛋白-1（ AP-1） 來介導細胞增殖和分化。而 JNK 和 P38MAPK 激酶介導細胞凋亡[11].

NF-κB 是最早發現的與細胞氧化還原狀態密切相關的轉錄因子。NF-κB 由 P50、P65 和抑制亞基 I-κB組成。I-κB 的磷酸化后被蛋白綴合酶降解，NF-κB活化入核從而發揮其作用。ROS 通過增強蛋白綴合酶的活性來促進 I-κB 的降解進而增強 NF-κB 的活化。

3. 2. 2. 3 活性氧與淋巴細胞凋亡 ROS 不僅可以促進淋巴細胞的活化和增殖，還可以調節淋巴細胞的凋亡。在免疫應答晚期，僅小部分的 T 細胞轉變成記憶細胞而存活，大部分的 T 細胞發生凋亡來維持機體內環境的穩定。淋巴細胞的凋亡可分為活化誘導的細胞凋亡（ AICD） ,及活化 T 細胞的自發死亡（ ACAD） .ROS 主要通過調控 Fas（ CD95） 的表達來調節 AICD.當 T 細胞處于靜息狀態 CD95 處于低水平，當 T 細胞活化后 ROS 通過調控 NF-AT、NF-κB轉錄因子來上調 CD95 的表達[7].當 Fas 與相應配體 FasL（ CD95L） 結合后，Fas 受體三聚化而活化，激活的受體與 FADD 結合，與 Caspase-8 相互作用使后者激活，形成死亡誘導信號復合物，再激活一系列的 Caspase-1,3,7 等，促進 Fas 蛋白所在細胞的凋亡發生[11].

ACAD 又稱受體饑餓性細胞凋亡或者線粒體途徑凋亡。其中 Bcl-2 家族是 ACAD 的主要作用因子。其中抗細胞凋亡的 Bcl-2 家族成員的表達水平對細胞存活起決定性作用[18].ROS 通過下調抗細胞凋亡的 Bcl-2（ BH-3 only） 分子來增加線粒體膜的通透性，增加線粒體通透性轉運孔道（ MPTP） 開放。

ROS 可氧化通透性轉換蛋白來影響線粒體的陰離子通道。當線粒體暴露于 H2O2,線粒體膜電位下降，細胞色素 C 釋放。而細胞色素 C 的釋放又會導致更多的 ROS 產生，這樣的正反饋放大過程加速細胞的凋亡。ASK1 是 JNK 的上游激酶，生理情況下ASK1 處于相對還原的狀態。ROS 的增加可以使ASK1 得酶活性恢復，激活下游的 JNK 途徑[4],并且ROS 可以直接通過抑制 GSTp 的磷酸化使其與 JNK分離來恢復 JNK 的活性促進細胞的凋亡。不難發現 ROS 調節淋巴細胞作用存在濃度差異，低濃度的增高產生正性信號有助于淋巴細胞的活化、增殖、分化； 而高濃度的增高則產生負性信號，促進淋巴細胞的凋亡。

4 結語

隨著我們對 ROS 了解的不斷深入，ROS 從無足輕重的氧化呼吸副產品轉變成細胞間信號轉導的重要成分。甚至在機體免疫中也發揮著不可忽視的作用，在先天免疫中不僅是主要殺傷病原體的武器還可以調節自然殺傷細胞的活性； 而在獲得性免疫，低濃度的 ROS 可以刺激淋巴細胞活化、增殖、分化，促進免疫激活； 而在高濃度的 ROS 刺激下淋巴細胞趨于凋亡，促進免疫終結?，F有多種疾病如腫瘤、哮喘、血液病、類風濕等發病機制都與免疫有關。弄清楚 ROS 對免疫系統的具體作用機制能為這些免疫相關的疾病提供新的治療思路。

參考文獻：

[1] Rada B,Hably C,Meczner A,et al. Role of Nox2 in elimination ofmicroorganisms[J]. Semin Immunopathol,2008,30: 237-253.

[2] Lam GY,Huang J,Brumell JH,et al. The many roles of NOX2NADPH oxidase-derived ROS in immunity[J]. Semin Immunopat,2010,32（ 4） : 415-430.

[3] Villamor N,Montserrat E,Colomer D. B lymphocyte mediated byreactive oxygen species[J]. Curr Pharm Des,2004,10 （ 8 ） :841-853.

[4] Toren Finke. Signal transduction by reactive oxygen species[J]. JCell Biol,2011,194（ 1） : 7-15.