單克隆抗體作為治療藥物始于上世紀 80 年代初，因其具有高度的特異性、有效性和安全性的特點，在惡性腫瘤、自身免疫性疾病、感染和器官移植排斥等多種疾病中取得了較好的治療效果，現已成為推動全球生物產業發展的引擎。截至 2014 年 11 月，已有 50 個抗體類藥物上市。2013 年全球銷售排名前十位的處方藥中有 6 個為抗體類藥物，分別是 Humira、Remicade、Mabthera、Enbrel、Avastin 和 Herceptin,單品種銷售額均超過 50 億美元[1].抗體藥物的接連上市和重磅銷售引發國內外抗體類生物治療藥物的研發熱潮。完善的質控標準是抗體類藥物批準上市的必要條件，面對抗體類藥物的快速發展，迫切需要建立相應的抗體藥物質量評價技術體系，而活性測定是對藥物的有效成分和含量以及藥物效價的測定，是確?？贵w類藥物有效性的重要質控指標?？贵w與其特異的靶點結合后，通過細胞因子信號的阻斷、補體系統的活化、細胞殺傷等生物學作用發揮重組抗體的治療作用，其生物學活性測定主要是在體外建立相應的細胞評價模型，模擬其作用機制，產生客觀的全程量效反應，并通過與活性標準品的比較對其生物學活性進行評價[2].近年來，轉基因細胞技術和一些新技術也被應用于抗體類藥物的生物學活性測定。本文將對應用于抗體藥物活性評價的傳統方法和前沿技術進行簡要介紹，為新型抗體藥物活性方法的建立提供新的思路。

1 基于細胞的生物活性測定方法

隨著藥物高通量篩選平臺的建立和生產規模的擴大，以及對 3R（ Reduction,Refinement,Replacement） 原則理解的不斷深化，人們越來越多地尋求動物實驗替代方法。而基于細胞系的體外生物活性分析方法由于其高通量、高效率、高精確度等優勢，越來越受到研究者和生產企業的青睞。單克隆抗體藥物的作用靶點分為細胞因子及其受體、腫瘤細胞表面抗原、CD 分子、病原微生物及其產物、以及其他靶點，根據抗體藥物作用的特點，目前主要有以下幾類基于細胞的測活方法。

1. 1 細胞增殖抑制法

針對生長因子靶點的抗體藥物多是采用細胞增殖抑制的方法來反映抗體的生物學活性，包括抗血管內皮生長因子（ vascular endothelial growth factor,VEGF）單抗、抗人表皮生長因子受體2（ human epidermal growthfactor receptor 2,HER2） 單抗及抗人表皮生長因子受體（ epidermal growth factor receptor,EGFR 或 HER1） 單抗等。其中抗 VEGF 單抗的經典測活方法是人臍靜脈內皮細胞（ human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）增殖抑制法，即在刺激因子 VEGF 存在的情況下，抗VEGF 單抗能夠以劑量依賴性的方式抑制 HUVEC 細胞的增殖?？?HER2 單抗[3]的活性測定通常選取 HER2陽性的乳腺癌細胞，如 BT474、SK-BR-3、SKOV3 等作為靶細胞，抗體與靶細胞表面 HER2 抗原結合后，能夠有效抑制細胞生長信號傳遞，從而抑制細胞增殖?？笶GFR 靶點單抗[4]也是通過特異結合并封閉表皮生長因子受體，有效抑制腫瘤細胞生長，如 DiFi 細胞、A431細胞增殖抑制法等。

1. 2 細胞毒性法

細胞凋亡有兩條途徑，一是線粒體依賴途徑，另一個為死亡受體介導途徑。腫瘤壞死因子-α （ tumornecrosis factor-alpha,TNF-α） 和受體結合后，可啟動死亡受體介導途徑，使 procaspe-8 自我水解、活化，形成活性caspase-8,后者再激活 caspase3、6、7 等，引起下面的級聯反應，導致細胞發生凋亡[5].重組人 II 型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白的活性測定可以利用其能夠抑制 TNF-α 所引起的敏感細胞系 U-937 中 caspase 3/7 活化，通過 Caspase-Glo 3/7 檢測試劑盒中螢光素酶發光信號的改變來反映該制品的活性。此外，針對 TNF-α的單抗還可以采用對 TNF-α 殺傷敏感的細胞系，如小鼠成纖維細胞 L929、小鼠纖維肉瘤細胞 WEHI164 等，抗體能夠抑制 TNF-α 所誘導的細胞凋亡作用，通過檢測細胞存活的染色來評價抗體的生物學活性。在細胞存活相關染料的選擇上，包括結晶紫、MTT、MTS、CCK-8等在內的染料具有各自的優缺點。結晶紫是一種三苯甲烷類染料，常用作生物染色劑和無機離子的顯色劑。

其染色過程雖然相對簡單，但是不能區分死活細胞，只能反映細胞數量。而 MTT 作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞還原成水不溶性的橙黃色甲臜產物并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，因此可間接反映活細胞數量，但 MTT 還原產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。MTS 還原產物是水溶性的甲臜，無需洗滌和溶解步驟，使用更方便，重復性優于 MTT.而 CCK-8 溶液可以直接加入到細胞樣品中，溶液相當穩定，對細胞沒有毒性，可長時間孵育，是用于測定細胞毒性或細胞增殖試驗中活細胞數目的一種簡便快速、靈敏度高、重復性好的染料。

1. 3 補體依賴的細胞毒法 （ complement dependentcytotoxicity,CDC）

單抗藥物與靶細胞表面分子結合后，可介導補體C1q 結合到抗體的 Fc 段，并于腫瘤細胞膜上形成類似于穿孔素效應的攻膜復合體（ membrane attack complex,MAC） ,造成細胞外離子大量內流，最終導致腫瘤細胞的溶解。CDC 生物學活性測定中一個的關鍵環節是補體的選擇及對其質量的控制，補體組分多，且熱不穩定，容易失活，目前所用的補體來源包括正常人血清、豚鼠、家兔等，來源復雜、劑型不同，因此在 CDC 實驗中需要考慮補體效力、穩定性，盡量減少活性測定反應終點和測定結果的變異。以 CD（ cluster of differentiation）分子為靶點的單抗藥物，如抗 CD20 單抗[6]、抗 CD52單抗等，其生物學活性評價方法主要為 CDC 活性測定，即將重組抗體進行系列稀釋后與高表達相應 CD 抗原的靶細胞結合，在補體存在的情況下，抗體與細胞表面抗原形成抗原抗體復合物，激活補體經典活化途徑，完成攻膜復合物的裝配并在細胞表面打孔，最終導致細胞溶解。利用上述檢測細胞存活的染料可以對抗體的CDC 作用效果進行評價。

1. 4 抗體依賴性細胞介導的細胞毒性法 （ antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）

單抗藥物通過 Fc 段介導的免疫效應除了 CDC 作用外，另外一個重要的效應即是抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（ ADCC） .傳統的 ADCC 檢測方法多為基于新鮮制備的外周血單個核細胞（ peripheral bloodmononuclear cell,PBMC ） 或者自然殺傷細胞 （ naturalkiller,NK） 作為效應細胞的殺傷試驗，以上方法存在細胞分離和培養困難、變異大、操作繁瑣、高背景值等缺陷[7].研究表明，在 NK 細胞中 Fc 受體（ FcR） 活化，尤其是 FcRγIIIa 受 體 （ CD16 ） 活 化 能 夠 引 起 NFAT（ nuclear factor of activated T-cells） 信號通路的激活。近年來基于報告基因法已建立了穩定而可靠的抗 CD20單抗的轉基因細胞 ADCC 評價方法。該方法以 WIL2-S細胞系（ 人 B 淋巴細胞） 作為靶細胞，使用工程改造的Jurkat 細胞作為效應細胞，該細胞穩定表達了 FcγRIIIa受體和由 NFAT 應答元件驅動表達的熒光素酶報告基因。當高表達 CD20 抗原的靶細胞與表達 FcγRIIIa 受體的 Jurkat 細胞通過抗 CD20 單抗橋聯時，可引起NFAT 熒光素酶報告基因的活化，通過檢測熒光素酶化學發光信號來反映抗體的 ADCC 效應[8].該方法操作簡便易行，專屬性強、重復性好、準確性高，可作為抗CD20 單抗 ADCC 生物學活性的常規檢查方法，用于評價包括人鼠嵌合單抗、人源化單抗、全人源單抗和糖基化改造單抗在內的各類抗 CD20 單抗的 ADCC 活性； 更重要的是該方法可用于評價糖基化修飾與抗 CD20 單抗功能的關系，這也為該類制品工藝穩定性評價及結構與功能關系研究奠定基礎。

1. 5 細胞 ELISA 法

除了檢測抗體對細胞的增殖和毒性作用外，還可以通過 ELISA 法[9]測定靶細胞與抗體及刺激因子共培養后分泌的細胞因子來評價抗體的生物學活性。例如抗 IL-17 單抗可以根據其抑制 IL-17 誘導靶細胞釋放IL-6 或 GROα 等細胞因子的能力來評價其生物學活性。將 IL-17 和 IL-17 單抗以及靶細胞接種到 96 孔板上，培養過夜。再通過 ELISA 法定量測定細胞上清液中分泌的細胞因子的含量，細胞因子的含量與抗體活性成反比。

2 轉基因細胞生物活性測定方法

由于很多生物技術藥物沒有強反應性的細胞系，或者沒有易檢測的細胞學效應，構建轉基因細胞株成了很好的選擇。構建藥物反應性轉基因細胞株是依據藥物的作用機制來制定方案的。首先應該全面深入地研究藥物的作用機制，包括受體激活、信號轉導、信號傳遞以及終效應，選擇合適的靶標作為藥物活性測定的指標。目前國內在建立轉基因細胞法測定生物治療藥物生物學活性領域已走在世界的前列。中國食品藥品檢定研究院通過多年的技術儲備，通過體外模擬創新藥作用的信號轉導機制，以“導入藥物作用受體、報告基因或效應分子”為策略，率先構建了簡便、快速、準確、非生物安全、動物替代的系列轉基因活性評價模型，其中干擾素測活的熒光素酶報告基因法，克服了國際通用的病毒抑制法中由操作活病毒導致的缺點，并使檢測周期縮短至原來的 1/3[10]; 腦利鈉肽測活的第二信使 cGMP 競爭檢測法，與傳統的家兔主動脈條法相比，變異系數由 66% 降至 13%[11]; 促紅細胞生成素的熒光素酶報告基因法無需復雜的動物實驗并可獲得與傳統體內紅細胞計數法高度一致的評價結果[12].系列研究成果實現了“轉基因細胞”理念用于解決一類新藥測活和傳統測活方法改進的突破，為保證用藥的安全性和時效性，提高檢驗質量提供了保障。

目前國際上已有多個靶點的單克隆抗體藥物應用報告基因法進行生物學活性測定[13].例如，血管內皮生長因子抑制劑（ VEGF Trap） 的活性測定方法是在HEK293 細胞中穩定轉染 NFκB 熒光素酶報告基因質粒和 2 個嵌合受體基因。這 2 個嵌合受體是將 VEGF受體 1 （ VEGFR1） 胞外區分別與 IL-18 受體 α （ IL-18Rα） 和 IL-18 受體 β （ IL-18Rβ） 胞內區融合而成。

VEGF 與 VEGFR1 結合后發生二聚化，使得 IL-18Rα 和IL-18Rβ 胞內結構域相互作用，并傳遞信號，引起 NFκB熒光素酶報告基因活化； 而 VEGF Trap 能夠抑制 VEGF所引起 NFκB 通路的激活[14-15].針對 PD-1 靶點的抗體是國內外新抗體研發的熱點，PD-1 表達于活化的 T 細胞，當與配體 PD-L1 和 PD-L2 結合后，可抑制 T 細胞的增殖以及相關細胞因子的產生[16].目前抗 PD-1 單抗大多采用競爭 ELISA 法來評價其結合活性，各研發單位也在積極探索穩定而可靠的抗 PD-1 單抗細胞生物學活性評價新方法。例如利用穩定轉染 NFAT 報告基因/PD-1 的 Jurkat 細胞作為效應細胞，高表達 PD-L1 的CHO 或 HEK293 轉基因細胞系作為靶細胞。通過微孔板包被的抗 CD3 抗體充分激活 Jurkat 后，將系列梯度稀釋的 PD-1 或 PD-L1 單抗與兩株細胞系經過一定時間的孵育后，通過熒光素酶檢測系統來評價抗 PD-1 或PD-L1 單抗的生物學活性。此外另一個免疫調節類的熱點抗體是針對 T 細胞表面的細胞毒性 T 淋巴細胞抗原 4（ Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4,CTLA4） 的抗體，它能夠阻止 CTLA-4 與其配體 （ B7. 1/CD80,B7. 2/CD86） 結合，從而恢復 CD28-B7 共刺激信號通路的信號傳導[14].針對 CTLA-4 單抗的生物學活性測定可以基于穩定轉染 IL-2 啟動子報告基因的 Jurkat 細胞，在Daudi B 細胞和抗 CD3 抗體的共同刺激下，抗 CTLA-4單抗能夠激活 Jurkat 細胞中 IL-2 信號通路，啟動熒光素酶表達，通過熒光素酶檢測系統進行該抗體生物學活性評價。

3 基于新技術的生物學活性測定方法

3. 1 表面等離子共振（ Surface Plasmon Resonance,SPR） 效價測定法

表面等離子共振現象是發生在兩種折射率不同的介質界面上的一種光學現象，最早于 1902 年由 Wood發現，并由 Otto 和 Kretschmann 等在 1968 年對其原理進行了詳盡的闡述。簡單而言，當光源的一束入射光從高折射率介質（ 如玻璃） 射向低折射率介質（ 如溶液）的界面時，如果入射角大于一定的臨界角，入射光將會被 100% 地反射至光源的同一側，這叫做全內反射現象。當兩種介質之間有一層極薄的金屬膜（ 最為常見的 50nm 金膜） ,這時入射光的能量將會引起金膜中等離子體的共振并以一種電磁場（ 稱作消逝波） 的方式彌散至低折射率介質一側（ 如溶液） ,從而導致反射光的能量在某個特定的角度降至最低（ 圖1） ,這一角度被稱作 SPR dip 角。表面等離子共振作為一種生物傳感器技術廣泛地應用于分子相互作用分析領域，當分子間發生結合或者解離時，會定量改變金膜表面附近分子的濃度，從而導致金膜附近折射率的變化，進而導致SPR dip 角的改變，通過實時監測 SPR dip 角度的變化，就可以實時分析分子間的結合與解離過程。該技術無需預先標記熒光、二抗的分子，避免了標記基團對分子構象的影響，從而反映出分子間真實的結合性質； 該技術樣品消耗量低，一般僅有微克級； 除了獲取一般的親和力信息外，還能夠給出對闡述分子間結合機理更為寶貴的動力學信息。SPR 技術已廣泛應用于小分子制藥和生物制藥領域[17-18],在抗體分析領域，其應用主要包括： （ 1） 抗體候選物的篩選與評價，如從雜交瘤上清液中篩選出解離速率最慢的抗體分子； （ 2） 抗體與抗原結合活性的分析，如人源化葉酸受體 α 單抗與重組人葉酸受體 α 的動力學與親和力[19]; （ 3） 抗體與受體結。合活性的分析，如抗體與 FcγRIIIa,FcγR IIIb 等受體結合的親和力、動力學信息； （ 4） 抗體活性濃度分析，包括基于標準品的活性成分濃度分析和無需依賴標準品的活性成分濃度分析方法； （ 5） 安全性評價中的免疫原性分析； （ 6） 生物類似藥一致性分析。

3. 2 均 相 時 間 分 辨 熒 光 （ Homogeneous Time-Resolved Fluorescence,HTRF）

均相時間分辨熒光是用來檢測純液相體系中待測物的一種常用方法，也是用來研究藥物靶標的理想平臺[20].該技術結合了熒光共振能量轉移（ FluorescenceResonance Energy Transfer,FRET） 和時間分辨熒光（ Time-Resolved Fluorescence,TRF ） 兩種技術。這種結合 將FRET 的均相實驗方式和 TRF 的低背景特點融合在一起，使得 HTRF 技術擁有操作簡單、靈敏度高、通量大、實驗數據穩定可靠、假陽性率較低的優勢。在 HTRF 實驗中，當供體和受體相離很近時，在供體和受體之間會有熒光共振能量轉移而產生信號。采用雙波長檢測能夠顯著減小緩沖液和培養基的干擾，最終的信號與產物形成的量成比例。HTRF 技術進入藥物研發領域以來，加快了很多基于抗體的研究，HTRF 技術也可以取代大部分ELISA,因為 HTRF 具有同等的檢測范圍和檢測極限，而且更節省實驗時間，并且不需要洗板的步驟，所以該技術近年來已被應用于抗體的活性檢測。例如，抗肝細胞生長因子（ hepatocyte growth factor,HGF） 單抗的結合活性測定就是一種競爭性抑制受體-配體結合的效價測定。

通過鑭系元素螯合物均相時間分辨熒光法（ LANCEHTRF） 測定抗 HGF 單抗與 HGF 結合，并阻止 HGF 結合至其受體的能力。在測定中，將銪標記的 HGF 受體（ hu-HGFR-Eu） 結合至生物素標記的 HGF（ biotin-huHGF） ,后者結合至鏈霉親和素-別藻藍蛋白（ SA-APC） .該結合誘導銪和 APC 分子接近，而使熒光發生共振能量轉移，通過具有檢測 HTRF 功能的酶標儀進行檢測?？?HGF 單抗能夠抑制biotin-huHGF 結合至hu-HGFR-Eu,并阻止能量轉移，因此降低了熒光信號輸出，即抗體的量與產生的熒光量呈負相關。

3. 3 Alpha 技術 （ Amplified Luminescent ProximityHomogeneous Assay）

該技術既可用于檢測細胞內各個 Biomarker,也可進行各類分子相互作用研究[21],簡單可靠。近年來，Alpha 技術也應用于抗體的活性檢測，該技術主要含有兩種微珠，一種為供體，另一為受體。當供體微珠所帶有的抗原分子（ A） 與受體微珠所帶有的抗體分子（ B）距離非常接近時，可以使用 680nm 激發光去引發其表面所帶有的光敏感物質，使其催化周圍的氧分子形成活化態，產生效率可達每秒 60 000 個氧分子活化態產生，借此將訊號放大，此活化態氧分子再與鄰近的受體微珠上的二甲基噻吩化合物產生化學冷光反應，產生冷光效應（ 波長大約 370nm） ,此冷光進一步借由能量轉換激發讓受體微珠產生 520 ~ 620nm 的發散光熒光信號，由于氧分子活化態非常不穩定，此反應相當快速僅 4μs,加上若此二種微珠距離超過 200nm,反應隨之下降，所以只有抗原抗體分子結合才能觸發反應，通過測定熒光量來反映抗體的活性（ 圖 2）

3. 4 熒光染料標記法

熒光染料標記法具有靈敏度高、選擇性高、方法簡便快捷、樣品用量少等優點，已經廣泛地應用于生物、化學、醫藥、衛生、農業、環境保護等領域中。應用在抗體活性檢測中，熒光染料可以標記分子或細胞。（ 1） 熒光染料標記細胞： 熒光染料作為熒光檢測分析方法的載體，其性能的優劣直接決定了檢測方法的可行性及靈敏性。Calcein-AM（ 鈣黃綠素-AM） 是一種可對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，Calcein-AM 由于在Calcein（ 鈣黃綠素） 的基礎上加強了疏水性，因此能夠輕易穿透活細胞膜。當其進入到細胞質后，酯酶會將其水解為 Calcein（ 鈣黃綠素） 留在細胞內，發出強綠色熒光。與其它同類試劑 （ 如 BCECF-AM 和 Carboxy-fluorescein diacetate） 相比，Calcein-AM 是最適合作為熒光探針去標記活細胞的，因為它的細胞毒性很低。

Calcein（ 鈣黃綠素） 不會抑制任何的細胞功能，如增殖或趨化性等。（ 2） 熒光染料標記分子： BODIPY（ 氟化硼二吡咯） 類熒光染料作為一類新型的熒光染料，因其良好的光物理性質，在過去的二十年內得到廣泛的研究。

與其它的熒光染料相比，BODIPY 類熒光染料具有較窄的吸收和發射峰、較高的摩爾吸光系數、較高的光穩定性和化學穩定性以及較高的熒光量子產率等。例如，抗 PCSK9 單抗的的生物活性測定即是用 BODIPY 標記的低密度脂蛋白（ LDL） 通過 HepG2 細胞來測定其生物活性。PCSK9 是前蛋白轉化酶枯草溶菌素 9,能與低密度脂蛋白受體（ LDLR） 直接結合，促使 LDLR 內化和降解。降低肝細胞上 LDLR 的數量能夠降低肝臟從循環中清除 LDL 的能力?？?PCSK9 抗體能夠與 PCSK9 結合，阻滯 PCSK9 與 LDLR 結合，增加 LDLR 數目，從而增加 HepG2 細胞中 BODIPY 標記的 LDL 熒光量。

4 生物學試驗的統計學分析

在生物活性的定量測定中，一般有兩種反應類型，一種是直線性反應，另一種是曲線性反應。關于選擇何種擬合模型和統計學分析軟件更合適的問題，主要從反應的實際曲線、擬合優度和簡便性三個方面考慮[22].目 前 美 國 藥 典 （ United States Pharmacopeia,USP） 、歐洲藥典（ European Pharmacopeia,EP） 等比較常用的 統 計 學 分 析 軟 件 包 括 UNISTAT、CombiStats、StatLIA、PLA、4-Parameter 等。PLA 2. 0 是一個不受硬件約束的，商業化的生物學分析軟件。它是 Stegmannsystem 的主要產品，目前有 200 余家公司在 GMP 環境下使用該軟件。該軟件基于歐洲藥典 5. 3 版、美國藥典和其他科學出版物。StatLIA Quantum 統計軟件在使用規模，數據儲存，可使用范圍，統計分析，人性化報告上具有很好的優勢，可用于活性檢測、定量檢驗、免疫原性質量篩選等方面。CombiStat 軟件是由 EDQM（ European Directorate for the Quality of Medicines &HealthCare） 研發，包括平行線分析、四參數和五參數、slope ratio model、probit model 等，在歐洲應用廣泛。我國研發單位對于生物學活性的評價應用四參數（ 4-Parameter） 模型擬合的較多，其數據呈典型的 S 型曲線，可反映出上下漸近線、EC50 值和斜率等指標。

USP、EP 等國外藥典都強調生物統計在生物學試驗中的應用及其重要性，尤其是在數據類型和分析模式、數據采集、穩定性試驗和離散度的選擇方面對于生物學試驗的設計和發展至關重要。然而統計學分析手段在2010 年版《中國藥典》三部治療性生物制品活性測定中的應用是總體基本缺失的，這個問題在未來應充分重視。

5 結 語

分子生物學的快速發展和細胞信號通路的深入研究促進了基于細胞的生物活性測定方法的發展，而轉基因細胞法特別是報告基因法的建立能更加快速、靈敏地反映抗體的生物學活性。越來越多的新型技術用于單抗藥物的活性檢測，可以實現對抗體藥物進行精準、多方位、動態的分析，為抗體藥物的質量提供了新的保障。本文對應用于抗體藥物活性評價的傳統方法和前沿技術進行了簡要介紹（ 表1） ,對國內抗體藥物研發企業在質量控制尤其是活性測定方面具有重要的指導作用和參考價值。

藥品的質量源于設計，而非靠檢測即可保證（ ICHQ8） ,這一國際公認的藥品質量控制理念已逐漸被研發主體、藥品監管機構接受，即藥品質量應該在基于對藥物分子生物學特性、作用機制全面了解的前提下，設計開發相應的生產工藝以求藥物分子達到其預期的質量屬性[23].對于抗體藥物的效價評價，在臨床情況下，采用反映產品生物學活性的生物測定是較好的方式，但在批放行中未必是可行的。對于利用動物實驗或原代細胞等操作復雜、變異性大的傳統活性測定方法，在充分了解產品特性和作用機制的情況下，基于新技術和新思路，開發穩定而可靠的活性替代方法用于放行中是可行的，其前提是研發主體要充分了解生產工藝、產品的質量屬性（ 包括生物學活性等） 以及藥效學的關系，開展傳統方法與新方法的比較和驗證研究，以求切實可行的確保產品有效、質量可控。

參考文獻

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