摘要： 目的 研究胰高血糖素樣肽素-1（ glucogon like peptide-1,GLP-1） 對晚期糖基化終產物 （ advanced glycation endproducts,AGEs） 誘導 H9C2 心肌細胞凋亡的保護作用機制。方法 體外培養 H9C2 細胞，實驗分為 4 組： 正常對照組、100 mg· L- 1AGEs 試驗組、AGEs （ 100 mg · L- 1） + GLP-1（ 10 nmol·L- 1） 組、AGEs（ 100 mg·L- 1） + NAC（ 5 mmol·L- 1） 組，處理 24 h.通過 CCK-8 比色法檢測細胞存活率，相差顯微鏡觀察細胞形態，雙氯熒光素（ DCFH-DA） 染色熒光顯微鏡攝片觀察細胞內活性氧（ ROS） 水平； RT-PCR 法測定Bax、Bcl-2 mRNA 基因的表達； 運用 Hoechst 33258 檢測試劑盒及流式細胞術檢測心肌細胞的凋亡率，Western blot 檢測凋亡相關蛋白 Bax、Bcl-2 的表達量。結果 與正常組相比，100 mg·L- 1AGEs 組降低 H9C2 細胞生存率，活性氧（ ROS）生成量增加； 與 AGEs 組相比，AGEs + GLP-1 組細胞生成率提高，活性氧（ ROS） 生成量減少。與正常組相比，AGEs 組促凋亡蛋白 Bax 表達增加，抑制凋亡蛋白 Bcl-2 減少，細胞凋亡率升高； AGEs + GLP-1 組較 AGEs 組下調促凋亡蛋白 Bax,上調凋亡抑制蛋白 Bcl-2,細胞凋亡率減少。結論 GLP-1 對AGEs 誘導的心肌細胞凋亡具有保護作用，其保護機制與減少活性氧（ ROS） 有關。
關鍵詞： 胰高血糖素樣肽素-1; 糖基化終產物； 活性氧；H9C2 心肌細胞； 凋亡； 心肌保護； 機制。
大量研究表明晚期糖基化終產物（ advancedglycation end proudct,AGEs） 在糖尿病心肌病的發生發展過程中發揮關鍵的作用[1 -2],AGEs 是機體在長期高糖狀態時蛋白質和還原糖之間經過非酶性糖基化反應生成的物質； AGEs 誘導心肌氧化應激，活性氧形成，進而導致細胞損傷、甚至凋亡。因此，發現抑制 AGEs 誘導心肌氧化應激并對其損傷性小的藥物尤為關鍵。
越來越多的研究證實，過多活性氧在心血管疾病發生發展中起到重要作用。如： 動脈粥樣硬化、心力衰竭[3 -4]等。另外心力衰竭、心肌病等心血管疾病的發生、發展與心肌細胞凋亡現象有關。心肌細胞凋亡是心肌缺血損傷機制中的一個重要環節，是引發心力衰竭的重要誘因； 其中活性氧 （ ROS） 介導的氧化應激在心肌細胞凋亡的病理過程中發揮了重要的作用[5 -6].
胰高血糖素樣肽-1 （ glucogen like peptide-1,GLP-1） 是機體中一種具有“腸促胰素效應”的腸源性激素，在發揮綜合降糖作用外，GLP-1 對心血管系統也有保護作用； 在血管內皮細胞中 GLP-1 能降低RAGE 表達，阻斷 AGEs / RAGE 軸造成的細胞損害[7 -8]; 同時發現 GLP-1 也可減少急性冠脈綜合征患者心肌梗死面積[9 -10].但 GLP-1 對 AGEs 誘導的 H9C2 心肌細胞損傷的作用未見報道。本實驗通過建立 AGEs 誘導 H9C2 心肌細胞損傷模型，探討GLP-1 對 AGEs 誘導 H9C2 心肌細胞損傷性保護作用及其可能機制。為 GLP-1 臨床上有效治療糖尿病心血管并發癥提供理論研究基礎。
1 材料與方法。
1. 1 細胞與主要試劑 H9C2 大鼠心肌細胞株由南昌大學第二附屬醫院實驗室細胞庫惠贈。AGEs（ 121800,Calbiochem,美國） ,DMEM-F12 培養基（Hyclone 公司，美國） ,胎牛血清（ BI 公司，以色列） ,GLP-1（ Sigma 公司，美國） ,Hoechst 33258 試劑盒購自南京建成生物工程研究所，N-acety-L-cysteine（NAC） 、活性氧檢測試劑盒、細胞計數 CCK-8 試劑盒均購于碧云天生物技術研究所，細胞凋亡檢測試劑盒 AnnexinV-FITC/PIKit （ 北 京 莊 盟） ,兔 抗 老 鼠GAPDH（ 10494-1-AP,Peprotech 公司產品，美國 ） ,Bax、Bcl-2（ 12789-1-AP） 多克隆抗體為 Peprotech 公司產品，CDI-165M 三氣細胞培養箱、BIO-BEST200E凝膠成像系統（ SIM 公司） ,TS100-F 倒置相差顯微鏡（ Nikon 公司，日本） ,超凈工作臺（ 蘇州凈化設備有限公司） ,冷凍高速離心機（ 珠海黑馬醫學儀器有限公司） ,水平電泳儀（ 北京六一儀器廠） ,PCR 儀（ BIO-RAD 公司） ,BDFACSCalibur 流式細胞儀（ BD公司，美國）。
1. 2 方法。
1. 2. 1 細胞培養與處理 H9C2 細胞培養于含體積分數為 0. 15 胎牛血清的 DMEM-F12 培養液，37 ℃ 、CO2體積分數 0. 05、飽和濕度條件下培養。細胞貼壁 80% 以上時，0. 25% 胰酶消化、計數、傳代，每 3 ~4 d 傳代 1 次。取接種對數生長期細胞進行實驗。
1. 2. 2 CCK-8 法檢測細胞成活率 取對數生長期細胞，以2 ×107·L- 1細胞濃度接種96 孔板，各實驗組設 4 個復孔，另設無細胞培養液孔為空白對照。根據 CCK-8 試劑盒說明書，處理結束后每孔加入10μL CCK-8 工作液。37 ℃ 培養 2 h,酶標儀（ El ×800,BioTek,USA） 記錄 450 nm 波長處的吸光度。取 4 孔光密度（ optical density,OD） 的平均值，按下列公式計算細胞存活率： 生存率/% = （ OD 處理組-OD 空白組） /（ OD 對照組 - OD 空白組） ×100% .實驗重復 3 次。
1. 2. 3 細胞內 ROS 水平的測定 根據實驗需要給予相應的處理： （ 1） 實驗對照組； （ 2） 100 mg·L- 1AGEs 處理 24 h; （ 3） 10 nmol·L- 1GLP-1 與100 mg·L- 1AGEs 處理 24 h; （ 4） 抗氧化劑（ NAC）與100 mg·L- 1AGEs 處理 24 h.均包括 3 個復孔。處理完成后，用 PBS 漂洗 6 孔板 2 次，用 10 μmol·L- 1DCFH-DA 染液于 37 ℃ 孵育 20 min.在熒光顯微鏡下隨機選取 5 個不重復區攝片，用 Image J1. 410 軟件分析 4 個視野綠色熒光強度的平均值，再對每組的各樣本進行統計分析。
1. 2. 4 Hoechst 33258 核染色法檢測心肌細胞凋亡H9C2 心肌細胞經不同因素處理后，小心棄去培養基，PBS 洗 1 遍，4%多聚甲醛固定 10 min,PBS 漂洗后，加入 5 mg·L- 1Hoechst 33258 試劑，室溫輕搖 30 min.在熒光顯微鏡 （ BX50-FLA,Olympus,Japan） 下攝片，染色質均勻分布，核被染成均勻藍色的細胞認為是正常細胞，核呈濃縮、碎裂的明亮藍色細胞認為是凋亡細胞，隨機選取視野在熒光顯微鏡下攝片。
1. 2. 5 RT-PCR 檢測凋亡相關基因 Bax、Bcl-2 mR-NA 的表達 將 H9C2 細胞按 1 × 106/ 孔接種于 6 孔板中，實驗分組同上，刺激細胞 24h 后，按 RNA 快速提取試劑盒說明書提取各組細胞總 RNA,采用兩步法 RT-PCR: 以 Olig（ dT） 為引物，以 M-MLV 反轉錄合成 cDNA,0. 01 瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性再行 PCR 擴增，PCR 反應體系： cDNA 0. 5 μL,上下游引物各 1 μL,Mix 12. 5 μL,ddH2O 10 μL,總體積 25μL.擴增產物采用 0. 01 瓊脂糖凝膠電泳 25 ~ 30min,凝膠成像系統照相，Image J 軟件進行灰度分析。如 Table1 所示：
關鍵詞： 胰高血糖素樣肽素-1; 糖基化終產物； 活性氧；H9C2 心肌細胞； 凋亡； 心肌保護； 機制。
大量研究表明晚期糖基化終產物（ advancedglycation end proudct,AGEs） 在糖尿病心肌病的發生發展過程中發揮關鍵的作用[1 -2],AGEs 是機體在長期高糖狀態時蛋白質和還原糖之間經過非酶性糖基化反應生成的物質； AGEs 誘導心肌氧化應激，活性氧形成，進而導致細胞損傷、甚至凋亡。因此，發現抑制 AGEs 誘導心肌氧化應激并對其損傷性小的藥物尤為關鍵。
越來越多的研究證實，過多活性氧在心血管疾病發生發展中起到重要作用。如： 動脈粥樣硬化、心力衰竭[3 -4]等。另外心力衰竭、心肌病等心血管疾病的發生、發展與心肌細胞凋亡現象有關。心肌細胞凋亡是心肌缺血損傷機制中的一個重要環節，是引發心力衰竭的重要誘因； 其中活性氧 （ ROS） 介導的氧化應激在心肌細胞凋亡的病理過程中發揮了重要的作用[5 -6].
胰高血糖素樣肽-1 （ glucogen like peptide-1,GLP-1） 是機體中一種具有“腸促胰素效應”的腸源性激素，在發揮綜合降糖作用外，GLP-1 對心血管系統也有保護作用； 在血管內皮細胞中 GLP-1 能降低RAGE 表達，阻斷 AGEs / RAGE 軸造成的細胞損害[7 -8]; 同時發現 GLP-1 也可減少急性冠脈綜合征患者心肌梗死面積[9 -10].但 GLP-1 對 AGEs 誘導的 H9C2 心肌細胞損傷的作用未見報道。本實驗通過建立 AGEs 誘導 H9C2 心肌細胞損傷模型，探討GLP-1 對 AGEs 誘導 H9C2 心肌細胞損傷性保護作用及其可能機制。為 GLP-1 臨床上有效治療糖尿病心血管并發癥提供理論研究基礎。
1 材料與方法。
1. 1 細胞與主要試劑 H9C2 大鼠心肌細胞株由南昌大學第二附屬醫院實驗室細胞庫惠贈。AGEs（ 121800,Calbiochem,美國） ,DMEM-F12 培養基（Hyclone 公司，美國） ,胎牛血清（ BI 公司，以色列） ,GLP-1（ Sigma 公司，美國） ,Hoechst 33258 試劑盒購自南京建成生物工程研究所，N-acety-L-cysteine（NAC） 、活性氧檢測試劑盒、細胞計數 CCK-8 試劑盒均購于碧云天生物技術研究所，細胞凋亡檢測試劑盒 AnnexinV-FITC/PIKit （ 北 京 莊 盟） ,兔 抗 老 鼠GAPDH（ 10494-1-AP,Peprotech 公司產品，美國 ） ,Bax、Bcl-2（ 12789-1-AP） 多克隆抗體為 Peprotech 公司產品，CDI-165M 三氣細胞培養箱、BIO-BEST200E凝膠成像系統（ SIM 公司） ,TS100-F 倒置相差顯微鏡（ Nikon 公司，日本） ,超凈工作臺（ 蘇州凈化設備有限公司） ,冷凍高速離心機（ 珠海黑馬醫學儀器有限公司） ,水平電泳儀（ 北京六一儀器廠） ,PCR 儀（ BIO-RAD 公司） ,BDFACSCalibur 流式細胞儀（ BD公司，美國）。
1. 2 方法。
1. 2. 1 細胞培養與處理 H9C2 細胞培養于含體積分數為 0. 15 胎牛血清的 DMEM-F12 培養液，37 ℃ 、CO2體積分數 0. 05、飽和濕度條件下培養。細胞貼壁 80% 以上時，0. 25% 胰酶消化、計數、傳代，每 3 ~4 d 傳代 1 次。取接種對數生長期細胞進行實驗。
1. 2. 2 CCK-8 法檢測細胞成活率 取對數生長期細胞，以2 ×107·L- 1細胞濃度接種96 孔板，各實驗組設 4 個復孔，另設無細胞培養液孔為空白對照。根據 CCK-8 試劑盒說明書，處理結束后每孔加入10μL CCK-8 工作液。37 ℃ 培養 2 h,酶標儀（ El ×800,BioTek,USA） 記錄 450 nm 波長處的吸光度。取 4 孔光密度（ optical density,OD） 的平均值，按下列公式計算細胞存活率： 生存率/% = （ OD 處理組-OD 空白組） /（ OD 對照組 - OD 空白組） ×100% .實驗重復 3 次。
1. 2. 3 細胞內 ROS 水平的測定 根據實驗需要給予相應的處理： （ 1） 實驗對照組； （ 2） 100 mg·L- 1AGEs 處理 24 h; （ 3） 10 nmol·L- 1GLP-1 與100 mg·L- 1AGEs 處理 24 h; （ 4） 抗氧化劑（ NAC）與100 mg·L- 1AGEs 處理 24 h.均包括 3 個復孔。處理完成后，用 PBS 漂洗 6 孔板 2 次，用 10 μmol·L- 1DCFH-DA 染液于 37 ℃ 孵育 20 min.在熒光顯微鏡下隨機選取 5 個不重復區攝片，用 Image J1. 410 軟件分析 4 個視野綠色熒光強度的平均值，再對每組的各樣本進行統計分析。
1. 2. 4 Hoechst 33258 核染色法檢測心肌細胞凋亡H9C2 心肌細胞經不同因素處理后，小心棄去培養基，PBS 洗 1 遍，4%多聚甲醛固定 10 min,PBS 漂洗后，加入 5 mg·L- 1Hoechst 33258 試劑，室溫輕搖 30 min.在熒光顯微鏡 （ BX50-FLA,Olympus,Japan） 下攝片，染色質均勻分布，核被染成均勻藍色的細胞認為是正常細胞，核呈濃縮、碎裂的明亮藍色細胞認為是凋亡細胞，隨機選取視野在熒光顯微鏡下攝片。
1. 2. 5 RT-PCR 檢測凋亡相關基因 Bax、Bcl-2 mR-NA 的表達 將 H9C2 細胞按 1 × 106/ 孔接種于 6 孔板中，實驗分組同上，刺激細胞 24h 后，按 RNA 快速提取試劑盒說明書提取各組細胞總 RNA,采用兩步法 RT-PCR: 以 Olig（ dT） 為引物，以 M-MLV 反轉錄合成 cDNA,0. 01 瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性再行 PCR 擴增，PCR 反應體系： cDNA 0. 5 μL,上下游引物各 1 μL,Mix 12. 5 μL,ddH2O 10 μL,總體積 25μL.擴增產物采用 0. 01 瓊脂糖凝膠電泳 25 ~ 30min,凝膠成像系統照相，Image J 軟件進行灰度分析。如 Table1 所示：
