丙泊酚作為常用的靜脈全身麻醉藥，通過激動GABA 受體和抑制 NMDA 受體發揮麻醉作用，具有起效快、蘇醒快、不良反應少等優點，廣泛用于麻醉誘導和維持。丙泊酚是否適用于新生兒和嬰幼兒的全身麻醉，目前觀點不一。研究表明 GABA 受體在發育期大腦作為一種興奮性神經遞質，激動GABA 受體引起氯離子外流使細胞膜去極化，產生興奮性神經毒性[1].最近動物實驗研究表明，反復大劑量使用丙泊酚可對發育期動物大腦產生損傷，導致發育期動物大腦廣泛腦區神經細胞凋亡的顯著增加，甚至影響動物成年后的學習記憶功能[2,3].
體外細胞實驗研究也表明丙泊酚具有發育期神經毒性，可誘導原代培養神經元凋亡[4,5].丙泊酚發育期神經毒性引起了眾多學者的廣泛關注，因此研究丙泊酚發育期神經毒性的發生機制以及尋找安全有效的措施防治丙泊酚發育期神經毒性已成為麻醉醫師關注的重要課題。以往研究表明 17β 雌二醇作為一種內源性神經甾體可對 GABA 受體激動劑苯巴比妥和 NMDA 受體抑制劑 MK-801 和氯胺酮產生的發育期大鼠大腦損傷產生保護作用[6 -8].
17β 雌二醇是否對丙泊酚誘導的原代培養皮層神經元凋亡產生保護作用以及機制尚不清楚，本實驗將從凋亡相關蛋白 Bcl-2、Bax 及 cleaved caspase-3 水平變化等方面研究 17β 雌二醇抑制丙泊酚誘導原代培養皮質神經元凋亡的機制，以期為臨床應用17β 雌二醇防治丙泊酚的發育期神經毒性提供實驗依據。
1 材料和方法。
1. 1 材料。
丙泊酚 （ Diprivan,意大利 AstraZeneca 公司，批號： KW814） ,20%脂肪乳購自廣州百特公司，DMEM培養液、胎牛血清、Neurobasal 培養液、B27 促生長劑購自美國 Gibco 公司，17β 雌二醇、DMSO 購自美國Sigma 公司，Hoechst 33258 和胰蛋白酶購自北京索來寶公司，TUNEL 試劑盒購自德國 Mannheim 公司，Bcl-2、Bax 及 cleaved caspase-3 抗體購自美國Cell Signal Technology 公司。
1. 2 方法。
1. 2. 1 皮層神經元原代培養： 取新生 24 h 內的 SD幼鼠（ 清潔級，體質量 5 ~ 6 g,雌雄不限，河北省實驗動物中心提供，生產許可證號： SCXK（ 冀） 2008- 1003） 大腦額葉皮層組織，用冷 PBS 洗劑，剪碎，移入 0. 125% 胰蛋白酶中置于 37℃ 水浴鍋內充分消化15 min,用含10%胎牛血清的 DMEM 培養基終止消化，吸棄上清液，然后把細胞轉移到含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基中用巴氏滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。然后經 100 目鋼絲篩過濾，計數后按 1 ×109/ L 的密度接種于經多聚賴氨酸處理的培養板中，放于 5% CO2培養箱 37℃恒溫培養 24 h后，全量換 Neurobasal + B27 培養基，以后每隔 2 d半量換液 1 次。體外培養 7 d 的神經元用于實驗。
1. 2. 2 實驗分組： 原代培養 7 d 的大鼠皮層神經元，隨機分為 3 組： 溶劑對照組（ 給予等溶劑 20% 脂肪乳） ,丙泊酚組（ 丙泊酚終濃度為 500 μmol/L） ,17β 雌二醇 + 丙泊酚組（ 17β 雌二醇終濃度為 0. 1μmol/L,17β 雌二醇加入 2 h 后，給予丙泊酚，其終濃度為 500 μmol/L） .
1. 2. 3 Hoechst 33258 核染色法檢測神經元凋亡：將神經元接種于 6 孔培養板中，按上述分組方法給予不同藥物處理后，移去培養液，用 4℃ PBS 沖洗 3遍后，加入 4%多聚甲醛固定 30 min,去除多聚甲醛固定液，用冷 PBS 液沖洗 3 遍，加入 Hoechest 33258染色8 min,PBS 漂洗3 遍，熒光顯微鏡下隨機選取5個視野進行形態學觀察和計數，計算凋亡率。凋亡率（ %） = 凋亡細胞數/細胞總數 × 100%.
1. 2. 4 應用 TUNEL 法檢測神經元凋亡： 應用TUNEL 法檢測神經元凋亡 將細胞涂片用 4% 多聚甲醛室溫下固定 30 min,然后 PBS 洗 3 次，0. 3%H2O2封閉內源性過氧化酶 30 min,然后在 0. 1%Triton X-100 的 0. 1% 檸檬酸鈉溶液中 4℃ 孵育 5min,將 50 μL TUNEL 反應液在 37℃ 濕盒中反應 60min,PBS 沖洗 3 次，然后再加入 50 μL 可轉變還氧化酶反應液，37℃ 濕盒中孵育 30 min,最后加入 50μL 底物反應液室溫反應 10 min.光鏡下觀察神經元，細胞核有棕黃色顆粒者為陽性神經元，采取 5 個不同的視野，計算陽性和陰性細胞數量。
1. 2. 5 Western blot 法測定 Bcl-2,Bax 及 cleavedcaspase-3 蛋白水平： 細胞經各種處理后，收集細胞，用細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白，用 BCA 法檢測蛋白含量。取待測蛋白質 50 μg 加上樣緩沖液煮沸變性，于 10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中 100 V 電泳 1. 5 h,轉膜 2 h,加入 Bcl-2,Bax 及cleaved caspase-3 抗體（ 1: 2 000） ,4℃ 過夜，常規洗滌，加羊抗鼠二抗（ 1: 5 000） ,37℃ 孵育 60 min,洗滌，電化學法發光，顯影，掃描，用凝膠圖像處理系統分析目標條帶與內參照條帶吸光度的比值。實驗重復 3 次，設 β-actin 蛋白為內參。
1. 2. 6 統計學方法： 數據應用 SPSS13. 0 統計軟件進行數據處理，數據均用均數 ± 標準差（ mean ±s） 表示，以 P < 0. 05 為差異有統計學意義。采用單因素方差分析和 SNK 檢驗進行數據分析。
